原代細(xì)胞周期測(cè)定操作步驟

 [實(shí)驗(yàn)器材]

1．儀器

原代細(xì)胞倒置顯微鏡，CO2培養(yǎng)箱，普通冰箱，超凈工作臺(tái)，低速冷凍離心機(jī)，顯微數(shù)碼攝影系統(tǒng)．水浴鍋。

2．材料與試劑

(1)非無(wú)菌材料酒精棉球，離心管架，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，擦鏡紙，記號(hào)筆，廢液缸，甲醇·冰醋酸，Giemsa染液．秋水仙素，2×SSC液，30W紫外燈，水浴，飯盒。

(2)無(wú)菌材料和試劑輔料鑷，6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)瓶，15ml離心管，長(zhǎng)絲滴管，10ml刻度移液管．滅菌塑料吸嘴，10％BS培養(yǎng)液，添加有0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶消化液．無(wú)菌Hank’s液，1.0mg／ml．BrdU溶液，1mol／L HCl溶液。

(3)細(xì)胞材料懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物，貼壁細(xì)胞培養(yǎng)物。

[操作步驟]

1．取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的單細(xì)胞懸液，以一定密度接種在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)孔中。

2．當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，向培養(yǎng)液中加入BrdU，使Z終濃度為10μg／ml。

3．培養(yǎng)44~54h后，加入秋水仙素，終濃度為0.1μg／ml。

4．繼續(xù)培養(yǎng)4~6h后，常規(guī)消化細(xì)胞至離心管中，原代細(xì)胞注意培養(yǎng)上清的漂浮細(xì)胞也要收集到離心管中。

5．常規(guī)染色體制片。

6．有細(xì)胞一面向下，將染色體玻片放在一飯盒中的玻璃支架上，加入2×SSC液以不超過(guò)標(biāo)本表面為宜，然后在標(biāo)本上覆蓋一張擦鏡紙，使紙的兩邊浸入2×SSC液中，以保持標(biāo)本的濕潤(rùn)。

7．將飯盒放在56℃水浴鍋中，濕育，上面用30W的紫外燈管6~10cm垂直照射30min。

8．棄去2×SSC液和擦鏡紙，立即用4℃左右的流水沖洗。

9．Giemsa液染色5~10min，流水沖洗，干燥后鏡檢。

10．鏡檢100個(gè)細(xì)胞的分裂相，統(tǒng)計(jì)M1、M2、M3、M4細(xì)胞期(對(duì)應(yīng)前期、中期、后期和末期這4個(gè)細(xì)胞分裂時(shí)期)分裂指數(shù)。

11．根據(jù)下式計(jì)算細(xì)胞周期

細(xì)胞周期(Tc)=48／[(Ml+2M2+3M3+4M4)／100](h)

[注意事項(xiàng)]

1．秋水仙素的加入時(shí)機(jī)會(huì)因細(xì)胞的類(lèi)型、生長(zhǎng)速度有所差異。

2．原代細(xì)胞加入BrdU后應(yīng)避光培養(yǎng)。