原代細胞培養(yǎng)的優(yōu)化方法

1)選用密度的健康細胞

細胞的匯合度應(yīng)為40–80%，并且傳代次數(shù)較低(比如小于50次)，即細胞不可太老。 隨著時間的推移，相對于較早傳代的細胞，培養(yǎng)原代細胞的表型和生長特性通常會呈多樣變化，這也會體現(xiàn)在表達譜中。

在培養(yǎng)條件影響下(例如頻繁的溫度和pH值變化、過度培養(yǎng)時培養(yǎng)基中的營養(yǎng)不足、繼代培養(yǎng)時細胞密度太低、胰蛋白酶連續(xù)處理、激烈吹打或離心時的剪切力以及支原體污染)，許多細胞的表達譜會發(fā)生改變。 每孔的細胞太少或太多，也會影響轉(zhuǎn)染效率。 根據(jù)轉(zhuǎn)染容器的表面積，嘗試不同的細胞密度，比如設(shè)置低、中、高密度的孔。

2)選擇恰當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基和培養(yǎng)條件

使用的組織培養(yǎng)操作方法。 siRNA遞送過程中，抗生素不是必需的，細胞吸收抗生素后可能會增加毒性。此外，一些siRNA轉(zhuǎn)染試劑要求在無血清或低血清的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染，所以一定要注意的建議。選擇恰當(dāng)?shù)募毎囵B(yǎng)基(例如某些細胞需要更多的葡萄糖或氨基酸)。

3)選用高質(zhì)量siRNA，使用Z低有效濃度

siRNA中應(yīng)不含從合成過程帶來的試劑(例如乙醇或鹽)。 長于30bp的雙鏈RNA污染物可通過激活非特異性的干擾素反應(yīng)，產(chǎn)生細胞毒性，從而改變基因的表達。 Ambion公司標(biāo)準(zhǔn)純度的siRNA沒有此類污染物，非常適合細胞培養(yǎng)實驗。原代細胞 在優(yōu)化遞送條件的實驗中，確定選用的方法和細胞類型所需siRNA的Z低有效濃度，過量使用siRNA會增加非特異性(脫靶)效應(yīng)。

4)使用siRNA陽性和陰性對照以及未處理的樣品來監(jiān)測每次實驗的siRNA遞送

每次實驗必須包含siRNA陰性和陽性對照，以便監(jiān)測siRNA的遞送效率(即比較siRNA陽性對照處理的和siRNA陰性對照處理的細胞靶標(biāo)基因的表達水平)。 在多數(shù)經(jīng)驗證的siRNA調(diào)控和細胞體系中，可看到mRNA調(diào)控靶標(biāo)抑制效率高于≥70%。 此外，應(yīng)通過比較siRNA陰性對照和未處理的樣品中培養(yǎng)的細胞活性來監(jiān)測siRNA遞送過程的細胞毒性。

5)優(yōu)化轉(zhuǎn)染試劑選擇和劑量

不同細胞系和細胞類型的轉(zhuǎn)染難度差別很大。 RNAiMax轉(zhuǎn)染試劑能夠有效地將小RNA遞送到各種細胞中，而且細胞毒性非常小。

對于難轉(zhuǎn)染的細胞系(如懸浮細胞、血液細胞、原代細胞和神經(jīng)細胞)，某公司的科學(xué)家們建議在不同的濃度下至少嘗試2種不同的轉(zhuǎn)染試劑。轉(zhuǎn)染試劑劑量不足會影響siRNA遞送和基因沉默效果，過多則會有細胞毒性。根據(jù)不同的細胞類型，需要不同數(shù)量的轉(zhuǎn)染試劑。

如果轉(zhuǎn)染結(jié)果不成功(基因抑制和/或細胞活性差)，可考慮采用電轉(zhuǎn)化方法或病毒載體來遞送siRNA。

6)優(yōu)化轉(zhuǎn)染試劑/siRNA復(fù)合物接觸時間：siRNA Complexes

轉(zhuǎn)染效率受轉(zhuǎn)染試劑/siRNA復(fù)合物的劑量影響。如果細胞毒性和靶基因抑制效率都很高，轉(zhuǎn)染8–24小時后，可利用正常培養(yǎng)基更換含有轉(zhuǎn)染試劑/siRNA復(fù)合物的培養(yǎng)基，從而降低細胞毒性并保持高的基因沉默效應(yīng)。

7)如有可能，監(jiān)測mRNA和蛋白的抑制

測量mRNA抑制效果，是監(jiān)測siRNA處理效果的Z直接的方法。通常在轉(zhuǎn)染24 - 48小時后，對靶mRNA水平進行定量。 某些情況下，也需要測量蛋白的抑制效果，從而了解siRNA處理產(chǎn)生的生物效應(yīng)——在siRNA遞送48–72小時后測量。 蛋白表達減少問題受mRNA和蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)率的影響;原代細胞對于不同的靶標(biāo)基因，觀察蛋白Z大抑制效果的時間存在差異。