細胞簡介：

小鼠骨內膜間充質干分離自股骨、脛骨；骨內膜是一層致密結締組織膜，覆蓋在骨的表面（關節面除外），新鮮骨內膜呈粉紅色，含有豐富的血管、神經和成骨細胞。此外，附著于骨的肌腱、韌帶于附著部位都與骨內膜編織在一起。因而骨內膜與骨質結合甚為牢固。骨內膜富含血管、神經，通過骨質的滋養孔分布于骨質和骨髓。骨內膜分內、外兩層，外層主要是粗大的膠原纖維束，部分纖維穿入骨質，使骨內膜固定于骨面；內層疏松，含成骨細胞和破骨細胞（分別具有產生新骨質和改建骨的功能）。骨髓腔和骨松質的網眼也襯著一層菲薄的結締組織膜，叫做骨膜。骨內膜的內層和骨膜有分化成骨細胞和破骨細胞的能力，以形成新骨質和破壞、改造已生成的骨質，所以對骨的發生、生長、修復等具有重要意義。骨內膜間充質干細胞是一種具有高度自我更新能力和多向分化潛能的干細胞，可以向骨、軟骨、肌組織、皮膚、脂肪、神經等多種組織分化，因此可以作為組織工程中的種子細胞。骨內膜間充質干細胞的體外培養條件要求較高，在培養過程中，受貼壁時間、種植密度、血清含量、培養溫度和培養基pH值等條件的影響。
方法簡介：

公司實驗室分離的小鼠骨內膜間充質干采用沖洗骨髓、消化骨內膜、差速貼壁法結合培養基篩選制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。
質量檢測：

公司實驗室分離的小鼠骨內膜間充質干經CD29、CD44免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

1) 將5-10d的乳鼠浸泡入75%乙醇中，移入生物安全柜，

2) 從胸部解剖乳鼠，取出雙肺置于預冷的PBS中，盡可能的除去結締組織等，

3) 取肺邊緣部分，剪碎，將組織塊移入T25培養瓶中，倒置于細胞培養箱中，

4) 2h后，培養瓶中注入2 mL內皮培養基，小心將培養瓶正置于培養箱，確保組織塊不會飄起來，

5) 每3d換液2mL，待細胞從組織塊中爬出來后，隔2d換液，待細胞融合達到60-70%左右時，去除組織塊，將肺微血管內皮細胞重新鋪瓶。

1、您收到細胞后，請按照以下方法進行操作：

取出T-25cm2培養瓶，75%酒精擦拭培養瓶，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2細胞培養箱中靜置4-6小時或過夜，以穩定細胞狀態，然后換用新鮮培養液繼續培養或進行傳代。

2、細胞傳代：

1）細胞生長至覆蓋培養瓶的80%面積時，棄25cm2培養瓶中的培養液，用PBS清洗細胞一次；

2）添加0.125%消化液約2ml至培養瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后加入培養液終止消化，再輕輕吹打細胞使之脫落，然后將懸液轉移至15ml離心管中，1500rpm/min，離心5min；

3）棄上清，沉淀細胞用12ml培養基重懸，然后按1:2比例進行分瓶傳代，放入37℃，5%CO2細胞培養箱中培養；

4）待細胞貼壁后，觀察培養結果，之后進行換液培養或傳代。

3、細胞凍存：

1）細胞生長至覆蓋培養瓶的80%面積時，棄25cm2培養瓶中的培養液，用PBS清洗細胞一次；

2）添加0.125%消化液約2ml至培養瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后輕輕吹打細胞使之脫落，再加入培養液終止消化，然后將懸液轉移至15ml離心管中，1500rpm/min，離心5min；

3）用適當量的凍存液（基礎培養基：FBS：DMSO=7:2:1）重懸細胞，并放置于凍存管中；

4）先將細胞凍存管放置于-20℃ 1.5h，然后將其移入-80℃過夜，24h后轉入液氮中進行長期保存。

4、細胞復蘇：

1）從液氮中取出細胞凍存管（注意：佩戴防爆管面具）， 快速將其置入37℃水浴中解凍，直至凍存管中無結晶，然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁；

2）將凍存管中的細胞移至15ml無菌離心管中，滴加入培養液5ml混勻細胞，然后將細胞懸液轉移至適當面積大小的培養皿中；

3）放置于37℃，5%CO2細胞培養箱中培養；

4）第二天，換用新鮮培養基繼續培養。