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人纖溶酶原激活劑抑制物（PAI-1）Elisa KitHuman PAI-1 ELISA Kit
人纖溶酶原激活劑抑制物Elisa Kit說明書【實驗用途】PAI-1，纖溶酶原激活劑抑制物。PAI-1是一種分子量為43KDa絲氨酸蛋白酶抑制物家族成員，主要作用是抑制組織型和尿激酶型纖溶酶原活化劑（t-PA，uPA）。PAI-1在調節t-PA活化纖溶酶原和uPA在細胞外間質的蛋白水解有重要作用。纖溶酶原激活劑的蛋白水解酶系統不僅對纖溶是重要的，對下面過程也是很重要的：即細胞外間質的再生；參與許多正常和病理的過程如血管的生成、排卵、胚胎的形成、血栓和出血的疾患；結締組織病變，瘤和敗血癥等。所提供的ELISA Kit是典型的夾心法酶聯免疫吸附測定試劑盒（ELISA）。預先包被的抗體為多克隆抗體。檢測相抗體也為多克隆抗體，經生物素（biotin）標記。樣品和生物素標記抗體先后加入酶標板孔反應后，PBS或TBS洗滌。隨后加入過氧化物酶標記的親和素反應；經過PBS或TBS的*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的待測因子呈正相關。

試劑配制:
1、人纖溶酶原激活劑抑制物Elisa Kit說明書酶聯板（Assay plate ）：一塊（96孔或者48孔）。
2、標準品（Standard）：2瓶（凍干品）。
3、樣品稀釋液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶。
4、生物素標記抗體稀釋液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶。
5、辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 （HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶。
6、生物素標記抗體（Biotin-antibody）：1×120μl/瓶（1：100）
7、辣根過氧化物酶標記親和素（HRP-avidin）：1×120μl/瓶（1：100）
8、底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。
9、濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10、終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
注意事項：
1加樣：
①人纖溶酶原激活劑抑制物Elisa Kit說明書實驗樣本過多時，可分批次操作，以減少實驗時間延長造成的誤差；
②加酶試劑后，用吸水紙吸干孔外試劑；
③作定量試驗時，使用加樣器加注試劑，并經常校正其準確性，此外，要做到一份樣本一個移液頭，防止交叉污染。
2.溫育：
①如有兩種溫度，盡量使用較低的溫育溫度、較長反應時間的條件；
②用1個小溫度計放置在板孔反應液中測量觀察；
③96孔板周圍孔與中心孔在溫育中的熱力學梯度會造成“邊緣效應”，因此盡量采用水??；
3.洗板：
①手工洗板時，拍板時要垂直，避免交叉污染，用力不能過猛，防止抗原抗體復合物脫離；
②洗板機洗板時應經常檢查沖洗頭是否通暢，若被雜物堵塞時可用注射器針頭挑出；
③為了洗滌效果好，實驗室可采用機器與人工洗滌相結合的方法，在機器洗滌后再進行人工洗板1-2次，或適當增加洗板的次數；
4.顯色：
ELISA試劑盒中，如以四甲基聯苯胺(TMB)為底物，則提供的底物為A和B兩瓶應用液；如以鄰苯二胺(OPD)為底物，則試劑盒提供鄰苯二胺片劑或粉劑。顯色反應條件為37℃或室溫反應15-30 min。以鄰苯二胺(OPD)為底物的試劑，要臨用前30 min配制且必須避光。以四甲基聯苯胺(TMB)為底物的試劑則不需避光，但A、B液應盡量避免接觸金屬器械。
5.判定：
讀取結果要在15-30 min內完成，定性測定用肉眼判讀試驗結果時，反應板應水平距離白色背景10-15 cm；定量測定時用酶標儀讀取結果，酶標儀不應置于陽光或強光照射下，需先預熱15-30 min再進行測試。
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操作步驟：
1）人纖溶酶原激活劑抑制物Elisa Kit說明書運用前，將所有試劑充沛混勻。不要使液體發生很多的泡沫，防止加樣時參加很多的氣泡，發生加樣上的差錯。
2）依據待測樣品數量加上規范品的數量決議所需的板條數。每個規范品和空白孔主張做復孔。每個樣品依據自個的數量來定，能運用復孔的盡量做復孔。標本用標本稀釋液1：1稀釋后參加50ul于反響孔內。
3）參加稀釋好后的規范品50ul于反響孔、參加待測樣品50ul于反響孔內。當即參加50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板，悄悄振動混勻，37℃溫育1小時。
4）甩去孔內液體，每孔加滿洗刷液，振動30秒，甩去洗刷液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。假如用洗板機洗刷，洗刷次數添加一次。
5）每孔參加80ul的親和鏈酶素-HRP，悄悄振動混勻，37℃溫育30分鐘。
6）甩去孔內液體，每孔加滿洗刷液，振動30秒，甩去洗刷液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。假如用洗板機洗刷，洗刷次數添加一次。
7）每孔參加底物A、B各50ul，悄悄振動混勻，37℃溫育10分鐘。防止光照。
8）取出酶標板，敏捷參加50ul停止液，參加停止液后應當即測定成果。
9）在450nm波利益測定各孔的OD值。