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Cy7,尸胺

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產(chǎn)品型號1 mg/5 mg

品       牌其他品牌

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所  在  地上海市

更新時間:2021-01-07 10:13:53瀏覽次數(shù):228次

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Cy7,尸胺實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限,實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度,并記錄在電腦軟件之中,通過對每個樣品Ct值的計算,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。

PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途,下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:

方法

1:在冰浴中,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix (2mM)             

4 μl     引物1(10pM)                 

2 μl     引物2(10pM)                 

2 μl     Taq酶 (2U/μl)               

1 μl     DNA模板(50ng-1μg/μl)  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

產(chǎn)品名稱

規(guī)格

貨號

Cy7,尸胺

1 mg/5 mg

BJP1135

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR早稱TaqMan PCR,后來也叫Real-Time PCR,是美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理:隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計,熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán),收集一個熒光強(qiáng)度信號,這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言,熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光背景信號階段,擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段, PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便,在實(shí)時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念:熒光閾值和 CT值。

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實(shí)時熒光定量PCR:

實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限,實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度,并記錄在電腦軟件之中,通過對每個樣品Ct值的計算,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此,實(shí)時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的:

1)Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時,剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期(對數(shù)期),此時微小誤差尚未放大,因此Ct值的重現(xiàn)性*,即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增,得到的Ct值是恒定的。

2)Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系,可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定,因此,實(shí)時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時熒光定量PCR是迄今為止定量準(zhǔn)確,重現(xiàn)性的定量方法,已得到*的*,廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究,藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

?

定量PCR方法:

a、競爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中,待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴(kuò)增(其中一個引物為熒光標(biāo)記)。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段,而待測模板不被酶切,可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開,分別測定熒光強(qiáng)度,根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物,內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記,下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時,內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中,由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同,二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來,分別測定其熒光強(qiáng)度,以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。

c、PCR-ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物,擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合,再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體-辣根過氧化物酶結(jié)合物,終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR-ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn),若加入內(nèi)標(biāo),作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的。

大鼠肺炎病毒抗體(PV-Ab)分析檢測試劑盒MyD88 (D80F5) Rabbit mAb500 ul

大鼠α葡萄糖苷酶(a-Glu)分析檢測試劑盒CD11c (3.9) Mouse mAb (redFluor™ 710 Conjugate)100 ul

大鼠Ras相關(guān)C3肉毒素底物1(RAC1)分析檢測試劑盒α-Tubulin (11H10) Rabbit mAb (Biotinylated)100 ul

大鼠P53(P53)分析檢測試劑盒Oct-4 (9B7) Mouse mAb100 ul

大鼠Na-K-ATP酶分析檢測試劑盒Phospho-AS160 (Thr642) Antibody100 ul

大鼠Ⅲ型前膠原氨基端肽(PⅢNT)分析檢測試劑盒K48-linkage Specific Polyubiquitin Antibody100 ul

大鼠3氧代5α類固醇4脫氫酶2(SRD5A2)分析檢測試劑盒HER2/ErbB2 (D8F12) XP® Rabbit mAb20 ul

猴抗肝細(xì)胞膜抗體(LMA)分析檢測試劑盒HER2/ErbB2 (D8F12) XP® Rabbit mAb100 ul

倉鼠載脂蛋白B(APOB)分析檢測試劑盒Cadherin-17 Antibody100 ul

海獅睪酮(T)分析檢測試劑盒PI3 Kinase p85 Antibody100 ul

植物激素脫落酸(ABA)分析檢測試劑盒PHLDA3 Antibody20 ul

魚卵黃高磷蛋白(PV)分析檢測試劑盒PHLDA3 Antibody100 ul

魚類促性腺激素釋放激素(GnRH)分析檢測試劑盒hnRNP A1 (K350) Antibody100 ul

人外周血白細(xì)胞報價CHFR Antibody100 ul

人視網(wǎng)膜muller細(xì)胞現(xiàn)貨供應(yīng)Akt (pan) (40D4) Mouse mAb (HRP Conjugate)100 ul

人脈絡(luò)膜微血管細(xì)胞報價IRF-4 (D43H10) Rabbit mAb100 ul

大鼠前列腺上皮細(xì)胞價格PDAP1 Antibody100 ul
Cy7,尸胺Bacillus│thioparans分離基物: 水樣/表層溫泉水斜面培養(yǎng)物安全等級: 1模式菌株: no應(yīng)用領(lǐng)域: 近海細(xì)菌培養(yǎng)基: 471生長條件: 50℃存儲條件: 液氮超低溫凍結(jié)法;-80℃冰箱凍結(jié)法;真空冷凍干燥法

Beauveria│bassiana (Bals.-Criv.) Vuill.分離基物: 幼蟲斜面培養(yǎng)物安全等級: 1模式菌株: no培養(yǎng)基: 14生長條件: 25存儲條件: -80℃冰箱凍結(jié)法;真空冷凍干燥法;定期移植法

Bacillus│cereus分離基物: 污泥凍干物安全等級: 2模式菌株: no應(yīng)用領(lǐng)域: 石油降解培養(yǎng)基: 0002生長條件: 30℃存儲條件: 液氮超低溫凍結(jié)法;真空冷凍干燥法

Streptomyces│sp.分離基物: 西茜草組織凍干物安全等級: 1模式菌株: no應(yīng)用領(lǐng)域: 藥用植物內(nèi)生菌培養(yǎng)基: CM0027生長條件: 28C存儲條件: 真空冷凍干燥

Saccharomyces│cerevisiae分離基物: 葡萄凍干物安全等級: 1模式菌株: no應(yīng)用領(lǐng)域: 果酒釀造培養(yǎng)基: CM0007生長條件: 35℃存儲條件: 真空冷凍干燥法

Candida│parapsilosis分離基物: 生物樣/尖葉鹵蕨莖斜面培養(yǎng)物安全等級: 1模式菌株: no應(yīng)用領(lǐng)域: 近海酵母培養(yǎng)基: 513生長條件: 28℃存儲條件: 液氮超低溫凍結(jié)法;-80℃冰箱凍結(jié)法

Salmonella│nyanza凍干物安全等級: 2模式菌株: no應(yīng)用領(lǐng)域: 11 z z6培養(yǎng)基: CM0051生長條件: 37℃存儲條件: -80℃冰箱凍結(jié)法;真空冷凍干燥法

鼠李糖乳桿菌種屬: Lactobacillus│rhamnosus凍干物安全等級: 1模式菌株: yes應(yīng)用領(lǐng)域: 分類學(xué)研究。用于葉酸輔酶研究、胞外核酸酶研究、乳酸脫氫酶性能測定、葉酸實(shí)驗(yàn)、尼克酸實(shí)驗(yàn)、泛酸實(shí)驗(yàn)和核黃素實(shí)驗(yàn)等研究;用于益生菌類食品生產(chǎn)。培養(yǎng)基: CM0793生長條件: 30℃存儲條件: 真空冷凍干燥法

Rhizobium│sp.分離基物: 根瘤斜面培養(yǎng)物安全等級: 1模式菌株: no培養(yǎng)基: 63生長條件: 28存儲條件: 定期移植法
實(shí)驗(yàn)過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2.對應(yīng)目的基因的特異引物(在PCR反應(yīng)中,新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制,而不能從無到有,憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物。可以是DNA也可以是RNA,一般20多bp,需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此,擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計不同的引物)

3.10×PCR Buffer

4.2mM dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5.Taq酶

二、操作步驟 

1.在冰浴中,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1(10pM)               2μl

       引物2(10PM)              2μl

       Taq酶(2U/μl)            1μl

      DNA模板(50ng-1μg/μl)    1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋,不加或添加石蠟油。

2.調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,執(zhí)行擴(kuò)增。一般:在93℃預(yù)變性3-5min,進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循環(huán)30-35次,zui后在72℃ 保溫7min。

3.結(jié)束反應(yīng),PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4.PCR的電泳檢測:如在反應(yīng)管中加有石蠟油,需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液,以除去石蠟油;否則,直接取5-10μl電泳檢測。

三、注意事項(xiàng)

1.PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。設(shè)立一個的PCR實(shí)驗(yàn)室。

2.純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言,只要能夠得到可靠的結(jié)果,純化的方法越簡單越好。

3.所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

4.PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水,采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

5.試劑都應(yīng)該以大體積配制,試驗(yàn)一下是否滿意,然后分裝成僅夠一次使用的量儲存,從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。

6.產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子,玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

7.PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開,并且要充分混勻。

 

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