逆轉(zhuǎn)錄后的 qPCR 實驗結果不理想分析,比如Ct 值偏大或者普通 PCR 產(chǎn)量低原因分析:
1、 RNA 模板質(zhì)量差,需要重新制備 RNA 模板,可通過瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量。
2、 逆轉(zhuǎn)錄后的 cDNA 中含有高濃度的模板 RNA 和逆轉(zhuǎn)錄試劑成分,可能會對后續(xù)的PCR 產(chǎn)生抑制作用,所以可以適當梯度提高 cDNA 稀釋比例(通常來說可將 cDNA 原液稀釋5-10倍,其最佳模板加入量以擴增得到的 Ct 值在20-30個循環(huán)為好)。
3、 起始的 RNA 模板量低,需要減少稀釋倍數(shù)或增加 RNA 模板量。
4、 基因本身原因(復雜和長度),可以重新設計復雜基因的引物,避免復雜結構。或者用三步法程序或延長兩步法程序的延伸時間。
5、 逆轉(zhuǎn)錄或者定量產(chǎn)品性能差,可以通過做平行不用品牌產(chǎn)品對比實驗,對比逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品性能。
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