在ELISA試劑盒中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后?？乖贵w反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間，這一保溫過程稱為溫育(incubation)，有人稱之為孵育，在ELISA 中似不恰當(dāng)。ELISA 屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。elisa試劑盒以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標(biāo)本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機(jī)會(huì)，只有zui貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個(gè)逐步平衡的過程，因此需經(jīng)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn)。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA 反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育。
ELISA試劑盒溫育常采用的溫度有 43℃、37℃、室溫和4℃(冰箱溫度)等。37℃是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。在建立ELISA 方法作反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，實(shí)驗(yàn)表明，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2 小時(shí)，產(chǎn)物的生成可達(dá)。為加速反應(yīng)，可提高反應(yīng)的溫度，有些試驗(yàn)在 43℃進(jìn)行，但不宜采用更高的溫度?？乖贵w反應(yīng)4℃更為*，在放射免疫測(cè)定中多使反應(yīng)在冰箱中，以形成zui多的沉淀。但因所需時(shí)間太長，在ELISA 中一般不予采用。
ELISA試劑盒保溫的方式除有的 ELISA 儀器附有特制的電熱塊外，一般均采用水浴，可將ELISA 板置于水浴箱中，ELISA 板底應(yīng)貼著水面，使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時(shí)可讓反應(yīng)板漂浮在水面上。若用保溫箱，ELISA 板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，zui后將ELISA 板放在濕紗布上。
濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預(yù)溫至規(guī)定的溫度，特別是在氣溫較低的時(shí)候更應(yīng)如此。無論是水浴還是濕盒溫育，反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應(yīng)，操作時(shí)的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指 20-25℃，但具體操作時(shí)可根據(jù)說明書的要求控制溫育。室溫溫育時(shí)，ELISA 板只要平置于操作臺(tái)上即可。應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證這一點(diǎn)，一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多于兩塊板同時(shí)測(cè)定。
一個(gè)良好的實(shí)驗(yàn)操作環(huán)境可以保證ELISA試劑盒測(cè)定結(jié)果更準(zhǔn)確。實(shí)驗(yàn)操作的嚴(yán)謹(jǐn)性與實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范密不可分，未使用的試劑應(yīng)儲(chǔ)存于2-8℃，使用時(shí)應(yīng)回溫到室溫（20-25℃）。切忌不同批次的試劑混合使用，要經(jīng)常檢查酶標(biāo)儀和微量移液器的精度盒準(zhǔn)備度，這樣才能保證實(shí)驗(yàn)的可操作性。