人抗核仁纖維蛋白抗體elisa試劑盒試驗所需自備物品:

1.  酶標儀(450nm波長濾光片)

2.  高精度移液器，EP管及一次性吸頭：0.5-10μl, 2-20μl, 20-200μl, 200-1000μl

3.  37℃恒溫箱, 雙蒸水或去離子水

4.  吸水紙

檢測前準備工作:

1. 請?zhí)崆?/span>20分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。

2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結晶，屬于正常現(xiàn)象，可用40℃水浴微加熱使結晶*溶解后再配制洗滌液。(加熱溫度不要超過50℃)使用時洗滌液應為室溫。

3.  標準品: 加入標準品&標本稀釋液1.0ml至凍干標準品中，靜置10分鐘，待其充分溶解后，輕輕混勻(濃度為5000 pg/ml)。然后根據(jù)需要進行倍比稀釋(注：不要直接在板中進行倍比稀釋)。建議配制成以下濃度： 2500、1250、625、312.5、156.2、78.1、39.05、0 pg/ml。樣品稀釋液直接作為空白孔 0 pg/ml。如配制2500pg/ml標準品：取0.5ml (不要少于0.5ml )5000pg/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的EP管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

4. *化抗體工作液：實驗前計算當次實驗所需用量(以100μl/孔計)，實際配制時應多配制100-200μl。使用前15分鐘，以*化抗體稀釋液稀釋濃縮*化抗體(1:100)成工作濃度。當日使用。

5. 酶結合物工作液：實驗前計算當次實驗所需用量(以100μl/孔計)，實際配制時應多配制  100-人天人抗核仁纖維蛋白抗體elisa試劑盒洗滌方法:

1. 自動洗板機：每孔加入洗滌液350μl，注入與吸出間隔60秒。洗板5次。

2. 手工洗板：甩盡孔內液體，在潔凈的吸水紙上拍干，每孔加洗滌液350μl，浸泡1-2分鐘，吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內的液體，在厚的吸水紙上拍干。洗板5次。

實驗開始前，各試劑均應平衡至室溫；試劑或樣品配制時，均需充分混勻，并盡量避免起泡。

1.加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl，余孔分別加標準品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。給酶標板覆膜，37℃孵育2小時。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。

2.棄去液體，甩干，每個孔中加入Detection Ab工作液 100μl(在使用前15分鐘內配制)，酶標板加上覆膜，37℃溫育1小時。

3.棄去孔內液體，甩干，洗板 3次，每次浸泡1-2分鐘，大約350μl /每孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內液體拍干。

4.每孔加HRP Conjugate工作液(臨用前15分鐘內配制)100μl，加上覆膜，37℃溫育1小時。

5.棄去孔內液體，甩干，洗板5次，方法同步驟3。

6.每孔加底物溶液100μl，酶標板加上覆膜37℃避光孵育15分鐘左右(根據(jù)實際顯色情況酌情縮短或延長，但不可超過30分鐘。當標準孔出現(xiàn)明顯梯度時，即可終止)。

7.每孔加終止液50μl，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。

8.立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度(OD值)。應提前打開酶標儀電源，預熱儀器，設置好檢測程序。

9.實驗完畢后將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回冰箱保存至有效期結束。
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