限制性內(nèi)切酶的主要功能是保護細菌不受噬菌體的感染，這一觀點已被人們廣泛接受。它們作為微生物免疫機制的一部分行使其功能。當一個沒有限制性內(nèi)切酶的細菌被病毒感染時，大部分病毒顆粒都能成功地進行感染。然而一個有限制性內(nèi)切酶的同種細菌被成功感染的比率顯著下降。出現(xiàn)更多的限制性內(nèi)切酶將會起到多重保護作用;而一個擁有4到5種各自獨立的限制性內(nèi)切酶將會使細胞堅不可摧。

限制性內(nèi)切酶常常伴隨一到兩種修飾酶（甲基化酶）出現(xiàn)。后者的作用是保護細胞自身的DNA不被限制性內(nèi)切酶破壞。修飾酶識別的位點與相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶相同，但只甲基化每條鏈中的一個堿基，而不是切開DNA鏈。限制性內(nèi)切酶識別位點處的甲基基團伸入到雙螺旋的大溝中去，阻礙了限制性內(nèi)切酶的作用。這樣，限制性內(nèi)切酶和它的"搭檔"--甲基化酶一起就構(gòu)成了限制-修飾（R-M）系統(tǒng)。在一些R-M系統(tǒng)中，限制性內(nèi)切酶和修飾酶是兩種不同的蛋白，它們各自獨立行使自己的功能;而在另一些系統(tǒng)中，兩種功能由同一種限制-修飾酶的不同亞基，或是同一亞基的不同結(jié)構(gòu)域來執(zhí)行。

傳統(tǒng)上將限制性內(nèi)切酶按照亞基組成、酶切位置、識別位點、輔助因子等因素劃分為三大類。然而，蛋白測序的結(jié)果表明，限制性內(nèi)切酶的變化多種多樣，若從分子水平上分類，則應(yīng)當遠遠不止這三種。

I型限制性內(nèi)切酶是一類兼有限制性內(nèi)切酶和修飾酶活性的多個亞基的蛋白復(fù)合體。它們在識別位點很遠的地方任意切割DNA鏈。以前人們認為I型限制性內(nèi)切酶很稀有，但現(xiàn)在通過對基因組測序的結(jié)果發(fā)現(xiàn)這一類酶其實很常見;盡管I型酶在生化研究中很有意義，但由于不產(chǎn)生確定的限制片段和明確的跑膠條帶，因而不具備實用性。

II型酶在其識別位點之中或臨近的確定位點特異地切開DNA鏈。它們產(chǎn)生確定的限制片段和跑膠條帶，因此是三類限制性內(nèi)切酶中*用于DNA分析和克隆的一類。II型限制性內(nèi)切酶由一群性狀和來源都不盡相同的蛋白組成，因而任意一種限制性內(nèi)切酶的氨基酸序列可能與另一種限制性內(nèi)切酶的氨基酸序列截然不同。實際上，從已知的情況上看，這些酶很可能是在進化過程中各自獨立產(chǎn)生的，而非來源于同一個祖先。

II型限制性內(nèi)切酶中zui普遍的是象Hha I、Hind III和Not I這樣在識別序列中進行切割的酶。這一類酶是構(gòu)成商業(yè)化酶的主要部分。大部分這類酶都以同二聚體的形式結(jié)合到DNA上，因而識別的是對稱序列;但有極少的酶作為單聚體結(jié)合到DNA上，識別非對稱序列。一些酶識別連續(xù)的序列（如EcoR I識別GAATTC）;而另一些識別不連續(xù)的序列（如Bgl I識別GCCNNNNNGGC）。限制性內(nèi)切酶的切割后產(chǎn)生一個3"羥基端和一個5"磷酸基團。它們的活性要求鎂離子，而相應(yīng)的修飾酶則需要S-甲硫氨酸腺苷的存在。這些酶一般都比較小，亞基一般都在200-300個氨基酸左右。

另一種比較常見的酶是所謂的IIS型酶，比如Fok I和Alw I，它們在識別位點之外切開DNA。這些酶的大小居中，約為400-650個氨基酸左右;它們識別連續(xù)的非對稱序列，有一個結(jié)合識別位點的域和一個專門切割DNA的功能域。一般認為這些酶主要以單體的形式結(jié)合到DNA上，但與臨近的酶結(jié)合成二聚體，協(xié)同切開DNA鏈。因此一些IIS型的酶在切割有多個識別位點的DNA分子時，活性可能更高。

第三種II型限制性內(nèi)切酶（有時也被稱為IV型限制性內(nèi)切酶）是一類較大的、集限制和修飾功能于一體的酶，通常由850-1250個堿基組成，在同一條多肽鏈上同時具有限制和修飾酶活性。有些酶識別連續(xù)序列，并在識別位點的一端切開DNA鏈;而另一些酶識別不連續(xù)的序列（如Bcg I：CGANNNNNNTGC），并在識別位點的兩端切開DNA鏈，產(chǎn)生一小段含識別序列的片段。這些酶的氨基酸序列各不相同，但其結(jié)構(gòu)組成是一致的。他們在N端由一個負責切開DNA的功能域，這個域又與DNA修飾域連接;此外還有一到兩個識別特異DNA序列的功能域構(gòu)成C端，或以獨立的亞基形式存在。當這些酶與底物結(jié)合時，它們或行使限制性內(nèi)切酶的功能切開底物，或作為修飾酶將其甲基化。

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