ELISA 檢測的目的是為實驗提供準確可靠的定量分析實驗依據。為了保證實驗數據的可靠性,在實驗過程中必須堅持全面質量控制和全過程質量控制。在收集標本前都必須有一個完整的計劃。ELISA樣本的處理是elisa試劑盒實驗關鍵的步驟!
標本類型:
ELISA 常見的標本一般包括:
◆ 液體類標本:包括血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細胞培養上清等。
◆ 培養細胞
◆ 組織標本
這些標本收集的時間、方法和保存都有一定的要求。
標本的保存:
一般說來,在5天內測定的標本可放置于 4℃,超過一周測定的需低溫凍存。
對收集后當天進行檢測的標本,儲存在 4℃備用,如有特殊原因需要周期收集標本,將標本及時分裝后放在 -20℃或 -70℃條件下保存。避免反復凍融。
標本2-8℃ 可保存48小時,-20℃可保存1個月,-70℃可保存6個月。
部分標本也可加入適當防腐劑,激素類標本需添加抑肽酶。
樣本的處理:
◆ 血清:
室溫血液自然凝固 10-20 分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。收集上清。如有沉淀形成,應再次離心。
◆ 血漿:
應根據試劑盒的要求選擇 EDTA 、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑,加入10 %(v/v)抗凝劑(0.1M 檸檬酸鈉或1% heparin 或 2.0%EDTA.Na2)混合10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。如有沉淀形成,應再次離心。
◆ 尿液、胸腹水、腦脊液:
用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。如有沉淀形成,應再次離心。
◆ 細胞培養上清:
檢測分泌性的成份時,用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。
檢測細胞內的成份時,用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細胞懸液,細胞濃度達到100萬/ml 左右。通過反復凍融,以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。
◆ 細胞:
檢測細胞的成份時,對于貼壁細胞,去除培養液,用PBS、生理鹽水或無血清培養液洗一遍。加入適量裂解液。用槍吹打數下,使裂解液和細胞充分接觸。
通常裂解液接觸細10秒后,細胞就會被裂解。
對于懸浮細胞,離心收集細胞,用PBS、生理鹽水或無血清培養液洗一遍.加入適量裂解液, 用槍吹打把細胞吹散。用手指輕彈以充分裂解細胞。充分裂解后應沒有明顯的細胞沉淀。
如果細胞量較多,必需分裝然后再裂解。充分裂解后,10000-14000g離心3-5分鐘,取上清,即可進行后續操作。
◆ 組織標本:
切割標本后,稱取重量。加入一定量的 PBS 或組織蛋白萃取試劑,緩沖液中可加入蛋白酶抑制劑。用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清置于 -20度或 -70度保存,如有必要,可以將樣品濃縮干燥。分裝后一份待檢測,其余冷凍備用。
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