酶聯(lián)免疫吸附測定腫瘤壞死因子試劑盒操作中標(biāo)本的收集

    用于ELISA測定的臨床標(biāo)本zui為常用的是血清（漿），有時因為特定的檢測目的，也用到唾液、腦脊液、尿液、糞便等標(biāo)本。目前使用血清（漿）標(biāo)本測定的標(biāo)志物一般有傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標(biāo)志物、激素、特種蛋白、細(xì)胞因子和治療藥物等。

    對用于激素和治療藥物測定的血清標(biāo)本的收集，要注意收集時間甚或體位有可能會對測定結(jié)果產(chǎn)生影響。如可的松在早晨4：00—6：00之間，會有一峰值出現(xiàn)；生長激素、促黃體激素（LH）和促卵泡激素（FSH）均以陣發(fā)性方式釋放，因此，在測定此類激素時，有必要在密切相連的時間間隔內(nèi)采取數(shù)份血樣本，以其中間值為測定值。

    又如當(dāng)從臥位變?yōu)檎玖⑽粫r，血清中腎素活性將出現(xiàn)明顯增高。再如治療藥物的檢測，應(yīng)根據(jù)藥代動力學(xué)選擇服藥后的zui適時間抽血檢測。用于傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標(biāo)志物和特種蛋白等的檢測的血清標(biāo)本的收集則沒有時間和體位方面的影響。

ELISA試劑盒操作步驟：

方法一　用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法

　　1.　包被：用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg/ml。在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃ 過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡稱洗滌，下同）。

　　2.　加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃ 孵育1小時。然后洗滌。（同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）。

　　3.　加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1ml。37℃ 孵育0.5～1小時，洗滌。

　　4.　加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分鐘。

　　5.　終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。

　　6.　結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。

方法二　用于檢測未知抗體的間接法

　　1.用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃過夜；

　　2.次日洗滌3次；

　　3.加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時,洗滌；

　　4.（同時做空白、陰性及陽性孔對照）于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體（抗抗體）0.1ml；

　　5.37℃孵育30-60分鐘，洗滌；

　　6.’zui后一遍用DDW洗滌。

　　其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。

試劑

　　（1）　包被緩沖液（PH9.60.05M碳酸鹽緩沖液）:

　　Na2CO3 1.59克

　　NaHCO3　2.93克

　　加蒸餾水至1000ml

　　（2）　洗滌緩沖液（PH7.4PBS）：0.15M

　　KH2PO4 0.2克

　　Na2HPO4·12H2O　2.9克

　　NaCl　8.0克

　　KCl　0.2克

　　Tween-20　0.05%　0.5ml

　　加蒸餾水至1000ml

　　（3）　稀釋液：

　　牛血清白蛋白（BSA） 0.1克

　　加洗滌緩沖液至100ml

　　或以羊血清、兔血清等血清與洗滌液配成5～10%使用。

　　（4）　終止液（2M　H2SO4）：

　　蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸（98%）21.7ml。

　　（5）　底物緩沖液（PH5.0磷酸棗檸檬酸）:

　　0.2MNa2HPO4（28.4克/L）25.7ml

　　0.1M檸檬酸（19.2克/L）　24.3ml

　　加蒸餾水50ml。

　　（6）　TMB（四甲基聯(lián)苯胺）使用液:

　　TMB（10mg/5ml無水乙醇）0.5ml

　　底物緩沖液（PH5.5）　10ml

　　0.75%H2O2　32μl

　　（7）　ABTS使用液:

　　ABTS　0.5mg

　　底物緩沖液（PH5.5）　1ml

　　3%H2O2　2μl

　　（8）　抗原、抗體和酶標(biāo)記抗體。

（9）　正常人血清和陽性對照血清。

器材

　　（1）　聚苯乙烯塑料板（簡稱酶標(biāo)板）40孔或96孔，ELISA檢測儀，50μl及100μl加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。

　　（2）　小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。

　　（3）　4℃冰箱，37℃孵育箱。

實(shí)驗條件的選擇

　　在ELISA中，進(jìn)行各項實(shí)驗條件的選擇是很重要的，其中包括:

　　（1）　固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一實(shí)驗條件下進(jìn)行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。

　　（2） 包被抗體（或抗原）的選擇：將抗體（或抗原）吸附在固相載體表面時，要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃ 18～24小時。蛋白質(zhì)包被的zui適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度（0.1、1.0和10μg/ml等）進(jìn)行包被后，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標(biāo)本的OD值。選擇OD值zui大而蛋白量zui少的濃度。對于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為1～10μg/ml。

　　（3）　酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價的滴定（見酶標(biāo)記抗體部份）。然后再固定其它條件或采取“方陣法”（包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度）在正式實(shí)驗系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。

　　（4）　酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無色。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作用，應(yīng)注意防護(hù)。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間后，應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。

自備材料

　　1． 蒸餾水。

　　2． 加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。

　　3． 振蕩器及磁力攪拌器等。

安全性

　　1． 避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。

　　2． 實(shí)驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。

　　3． 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

腫瘤壞死因子試劑盒操作注意事項

　　1． 試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄，不可保存。

　　2． 實(shí)驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。

　　3． 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。

　　4． 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。

　　5． 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

　　6． 洗滌酶標(biāo)板時應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。

　　7． 底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實(shí)驗完成后應(yīng)立即讀取OD值。

　　8． 加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。

　　9． 按照說明書中標(biāo)明的時間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。

   Elisa試驗是一種敏感性高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好的實(shí)驗診斷方法。由于其試劑穩(wěn)定、易保存，操作簡便，結(jié)果判斷較客觀等因素，已廣泛應(yīng)用在免疫學(xué)檢驗的各領(lǐng)域中。ELISA檢測試劑盒是用于體外定性檢測人血清或血漿中的抗人類戊型肝炎（HEV）病毒 IgM 抗體ELISA檢測。

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