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1.冷凍原則
冷凍細胞之活化原則為快速解凍,以避免冰晶重新結晶而對細胞造成傷害,導致細胞之死亡。
2.細胞活化后,約需數(shù)日,或繼代一至二代。其細胞生長或特性表現(xiàn)才會恢復正常(例如產(chǎn)生單株抗體或是其它蛋白質(zhì))。
3.材料 :
①37 oC 恒溫水槽
②新鮮培養(yǎng)基
③無菌吸管/ 離心管/ 培養(yǎng)瓶
④液氮或干冰容器
4.操作步驟:
①操作人員應戴防護面罩及手套,防止冷凍管可能爆裂之傷害。
②自液氮或干冰容器中取出冷凍管,檢查蓋子是否旋緊,由于熱脹冷縮過程,此時蓋子易松掉。
③將新鮮培養(yǎng)基置于37 °C 水槽中回溫,回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之,移入無菌操作臺內(nèi)。
④取出冷凍管,立即放入37 °C 水槽中快速解凍,輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化,以70%ethanol 擦拭保存管外部,移入無菌操作臺內(nèi)。
⑤取出0.9 ml 解凍之細胞懸浮液,緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)(稀釋比例為1:10~1:15),混合均勻,放入CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。另取0.1 ml 解凍細胞懸浮液作存活測試。
⑥解凍后是否立即去除冷凍保護劑(例如DMSO 或glycerol),依細胞種類而異,一般而言,大都不需要立即去除冷凍保護劑。惟若要立即去除,則將解凍之細胞懸浮液加入含有5-10 ml 培養(yǎng)基之離心管內(nèi),離心1,000 rpm, 5 分鐘,移去上清液,加入新鮮培養(yǎng)基,混合均勻,放入CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
⑦若不需立即去除冷凍保存劑,則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。
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