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兩種不同的總蛋白提取方法總結(jié)

時(shí)間:2019/10/31閱讀:595
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    蛋白質(zhì)提取與制備蛋白質(zhì)種類很多,性質(zhì)上的差異很大,既或是同類蛋白質(zhì),因選用材料不同,使用方法差別也很大,且又處于不同的體系中,因此不可能有一個(gè)固定的程序適用各類蛋白質(zhì)的分離。本文分別介紹了從新鮮樣品中提取總蛋白和從Trizol裂解液中分離總蛋白的方法和步驟。希望與各位老師和同學(xué)交流。

    膜蛋白具有多種功能,在細(xì)胞識(shí)別、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、運(yùn)輸?shù)扔兄兄匾慕巧虼艘彩堑乃幬锇悬c(diǎn)。抽提膜蛋白主要是進(jìn)行蛋白組分析:常用的實(shí)驗(yàn)是非變性膠電泳、酶活分析、SDS-PAGE、western blot等。本文敘述了總蛋白的抽提方法、和膜蛋白的提取方法。

    一、從新鮮樣品中提取總蛋白(簡易法)

    1.自配裂解液(pH 8.5-9.0):50 mM Tris-HCl,2 mM EDTA, 100 mM NaCl,0.5% Triton X-100,調(diào)pH值至8.5-9.0備用;用前加入100 μg/ml 溶菌酶,1μl/ml的蛋白酶抑制劑PMSF。該裂解液用量為10-50ml 裂解液/1g濕菌體。

    2.將40ml 菌液在12000g,4℃下離心15分鐘收集菌體,沉淀用PBS懸浮洗滌2遍,沉淀加入1ml裂解液懸浮菌體。

    3.超聲粉碎,采用300w,10s超聲/10s間隔,超聲20min,反復(fù)凍融超聲3次至菌液變清或者變色。

    4.1000g離心去掉大碎片,上清可直接變性后PAGE電泳檢測(cè),或者用1% SDS溶液透析后凍存。

    缺點(diǎn):Western Blotting結(jié)果表明,疏水性跨膜蛋白提取效率有限。

    二、從Trizol裂解液中分離總蛋白

    1.Trizol溶解的樣品研磨破碎后,加氯fang分層,2-8℃下10000g離心15min,上層水相用于RNA提取,體積約為總體積的60%。

    2.用乙醇沉淀中間層和有機(jī)相中的DNA。每使用1ml Trizol加入0.3ml無水乙醇混勻,室溫放置3min,2-8℃不超過2000g離心5min。

    3.將上清移至新的EP管中,用異丙醇沉淀蛋白質(zhì)。每使用1ml Trizol加入1.5ml異丙醇,室溫放置10min,2-8℃下12000g離心10min,棄上清。

    4.用含有0.3M 鹽酸胍的95%乙醇洗滌。每1ml Trizol加入2ml洗液,室溫放置20min, 2-8℃下7500g離心5min,棄上清,重復(fù)洗滌2次。Z后加入2ml無水乙醇,渦旋后室溫放置20min,2-8℃下7500g離心5min,棄上清。

    5.冷凍干燥5-10min,1%SDS溶液溶解,反復(fù)吹打,50℃溫浴使其*溶解,2-8℃下10000g離心10min去除不溶物。

    6.替代方案:將3中的酚醇上清液移至小分子量透析袋中,在2-8℃的1% SDS溶液中透析3次,1000g離心10min去除沉淀,上清可直接用于蛋白實(shí)驗(yàn)。

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