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細(xì)胞轉(zhuǎn)染需要注意的6大點

時間:2019/10/24閱讀:769
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    轉(zhuǎn)染是將外源性基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)的一種專門技術(shù)。分為物理介導(dǎo)方法:電穿孔法、顯微注射和基因槍;化學(xué)介導(dǎo)方法:如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、和多種陽離子物質(zhì)介導(dǎo)的技術(shù);生物介導(dǎo)方法:有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染,和現(xiàn)在比較多見的各種病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)。理想細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法,應(yīng)該具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性小等優(yōu)點。病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù),是目前轉(zhuǎn)染效率gao的方法,同時具有細(xì)胞毒性很低的優(yōu)勢。但是病毒轉(zhuǎn)染方法的準(zhǔn)備程序復(fù)雜,常常對細(xì)胞類型有很強(qiáng)的選擇性,在一般實驗室中很難普及。其它物理和化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法,則各有其特點。需要指出的一點,無論采用哪種轉(zhuǎn)染技術(shù),要獲得you的轉(zhuǎn)染結(jié)果,可能都需要對轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化。影響轉(zhuǎn)染效率的因素很多,從細(xì)胞類型、細(xì)胞培養(yǎng)條件和細(xì)胞生長狀態(tài)到轉(zhuǎn)染方法的操作細(xì)節(jié)。

    一、血清

    1.DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物形成時不能含血清,因為血清會影響復(fù)合物的形成。

    2.一般細(xì)胞對無血清培養(yǎng)可以耐受幾個小時沒問題,轉(zhuǎn)染用的培養(yǎng)液可以含血清也可以不加,但血清一度曾被認(rèn)為會降低轉(zhuǎn)染效率,轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中加入血清需要對條件進(jìn)行優(yōu)化。

    3.對于對血清缺乏比較敏感的細(xì)胞,可以使用營養(yǎng)豐富的無血清培養(yǎng)基,或者在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中使用血清。對血清缺乏比較敏感的貼壁細(xì)胞,建議使用轉(zhuǎn)染試劑。有條件的話,可以用無血清培養(yǎng)基代替PBS洗細(xì)胞兩遍,注意洗的時候要輕,靠邊緣緩緩加入液體,然后不要吹吸細(xì)胞,而是轉(zhuǎn)動培養(yǎng)板讓液體滾動在細(xì)胞表面。如果洗的太厲害,細(xì)胞又損失一部分,加了脂質(zhì)體后,細(xì)胞受影響就更大了,死亡細(xì)胞會增多。

    二、抗生素(PS)

    抗生素,比如青霉素和鏈霉素,是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般對于真核細(xì)胞無毒,但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性,使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞。這降低了細(xì)胞的活性,導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。所以,在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用抗生素,甚至在準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染前進(jìn)行細(xì)胞鋪板時也要避免使用抗生素。這樣,在轉(zhuǎn)染前也不必潤洗細(xì)胞。對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素,ICIN選擇性抗生素的競爭性抑制劑。另外,為了保證無血清培養(yǎng)基中細(xì)胞的健康生長,使用比含血清培養(yǎng)基更少的抗生素量。

    三、細(xì)胞狀態(tài)

    這點非常重要,不要急于求成,一定要讓細(xì)胞處于jia的生長狀態(tài)再做。有文獻(xiàn)說傳代不要超過17代。細(xì)胞復(fù)蘇后的3代左右時細(xì)胞狀態(tài)hao,不要用傳了很多代的細(xì)胞去做,細(xì)胞的形態(tài)都會發(fā)生變化。大多數(shù)已建立的細(xì)胞系都是非整倍體,原代培養(yǎng)包括了表達(dá)不同基因組合的細(xì)胞的混合物。細(xì)胞培養(yǎng)在實驗室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變,總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化。這會導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。如果隨時間發(fā)現(xiàn)這種變化,融化一管新鮮的細(xì)胞可能會恢復(fù)原先的轉(zhuǎn)染活性。因此,如果觀察到轉(zhuǎn)染效率降低,可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞以恢復(fù)jia結(jié)果?;蛘撸瑤追N來源于經(jīng)篩選,轉(zhuǎn)染效率較高細(xì)胞亞系的細(xì)胞系現(xiàn)在有售。

    四、細(xì)胞鋪板密度

    用于轉(zhuǎn)染的jia細(xì)胞密度根據(jù)不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異。因轉(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞有毒害作用,細(xì)胞太少,容易死。一般轉(zhuǎn)染時,貼壁細(xì)胞密度為70%-90%,懸浮細(xì)胞密度為2-4×106細(xì)胞/ml,確保轉(zhuǎn)染時細(xì)胞沒有長滿或處于靜止期。因為轉(zhuǎn)染效率對細(xì)胞密度很敏感,所以在不同實驗間保持一個基本的傳代步驟很重要。鋪板細(xì)胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細(xì)胞產(chǎn)量。細(xì)胞的融合度必須要達(dá)到90%才能做。

    五、啟動子的選擇

    獲得高轉(zhuǎn)染活性所需選擇的啟動子依賴于選用的細(xì)胞系和要表達(dá)的蛋白。CMV啟動子在大多數(shù)細(xì)胞類型中可以獲得高表達(dá)活性。同其他啟動子,如SV40和RSV(勞斯肉瘤病毒)相比,在BHK-21中其活性gao。這三種病毒啟動子在T細(xì)胞來源的細(xì)胞系,如Jurkat中組成表達(dá)水平較低。轉(zhuǎn)染后在培養(yǎng)基中加入PHA-L和PMA可以激活Jurkat細(xì)胞中CMV啟動子,而單PMA就足以激活KG1和K562(人骨髓瘤白細(xì)胞)中的CMV啟動子。SV40啟動子的表達(dá)在含有大T抗原(存在于COS-1和COS-7)時會提高,因為大T抗原可以刺激染色體外的合成。

    六、DNA量

    高質(zhì)量的DNA對于進(jìn)行的轉(zhuǎn)染至關(guān)重要。轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒一定純度好、濃度高、無內(nèi)毒素。濃度不要低于0.35ug/ul。產(chǎn)物表達(dá),48小時mRNA表達(dá)gao;72h蛋白表達(dá)gao。

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