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無血清培養(yǎng)基的使用方法

時(shí)間:2019/9/6閱讀:839
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    使用方法

    目前,血清仍是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中zui基本的的添加物,尤其是在原代培養(yǎng)或者細(xì)胞生長狀況不良時(shí),常常會(huì)先使用有血清的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),待細(xì)胞生長旺盛以后,再換成無血清培養(yǎng)液。細(xì)胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)要有一個(gè)適應(yīng)過程,一般要逐步降低血清濃度,從10%減少到5%,3%,1%,直至無血清培養(yǎng)。在降低過程中要注意觀察細(xì)胞形態(tài)是否發(fā)生變化,是否有部分細(xì)胞死亡,存活細(xì)胞是否還保持原有的功能和生物學(xué)特性等。在實(shí)驗(yàn)后這些細(xì)胞一般不再繼續(xù)保留,很少有細(xì)胞能夠長期培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基而不發(fā)生改變的。細(xì)胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)之前,要留有種子細(xì)胞,種子細(xì)胞按常規(guī)培養(yǎng)于含血清的培養(yǎng)基中,以保證細(xì)胞的特性不發(fā)生變化。

    為了使細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng),關(guān)鍵的是使所培養(yǎng)細(xì)胞:

    1.處于對數(shù)生長中期

    2.>90%活細(xì)胞率

    3.適應(yīng)時(shí)以較高的起始細(xì)胞接種

    細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)基的方法

    1.直接適應(yīng)——細(xì)胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無血清培養(yǎng)基(SFM)中。

    一些類型細(xì)胞可直接從包含血清的培養(yǎng)基適應(yīng)無血清培養(yǎng)基。對于直接適應(yīng),接種細(xì)胞密度應(yīng)該:2.5×105~3.5×105細(xì)胞/ml。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×106~3×106細(xì)胞/ml時(shí),傳代培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞密度在培養(yǎng)4到7天后達(dá)到2×106~4×106細(xì)胞/ml時(shí),細(xì)胞*適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基。每隔3~5天,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×106~3×106細(xì)胞/ml,細(xì)胞活率在90%時(shí),貯備的適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。

    2.連續(xù)適應(yīng)——分好幾步把細(xì)胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無血清培養(yǎng)基(SFM)中,與直接適應(yīng)相比較,連續(xù)適應(yīng)趨向?qū)τ诩?xì)胞更加溫和一些。

    (1)以2倍正常接種密度接種生長活躍的細(xì)胞培養(yǎng)物到75%有血清培養(yǎng)基:25%SFM混合培養(yǎng)基中,傳代培養(yǎng)。

    (2)當(dāng)細(xì)胞密度>5×105細(xì)胞/ml時(shí),以2×105到3×105細(xì)胞/ml細(xì)胞密度,在有血清培養(yǎng)基:SFM為50∶50的混合培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。

    (3)以2×106到3×106細(xì)胞/ml細(xì)胞密度,25%有血清培養(yǎng)基和75%SFM中傳代培養(yǎng)。

    (4)當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×106到3×106細(xì)胞/ml(接種后4到6天),在100%SFM培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。

    (5)每隔3到5天,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×106到3×106細(xì)胞/ml,細(xì)胞活率在90%時(shí),貯備的適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。

    建議備份前一次混合培養(yǎng)的培養(yǎng)物,直到每一次細(xì)胞適應(yīng)了新的混合培養(yǎng)基。每一次減少血清前,可能需要在SFM/有血清混合培養(yǎng)基中進(jìn)行幾次傳代。

    在適應(yīng)過程中,不要讓細(xì)胞生長過度。這將增加選擇亞群的可能性。需要注意,與有血清培養(yǎng)基相比,大部分SFM包含非常少的蛋白質(zhì),因而更易于受外界因素的影響。

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