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Anti-CXCL10/IP-10CXCL10趨化因子10/干擾素誘導(dǎo)蛋白10抗體

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更新時間:2016-11-25 06:08:25瀏覽次數(shù):223次

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抗體儲存容器應(yīng)由不吸附蛋白質(zhì)的材料制成,常用的有聚丙烯,聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如儲存的抗體中蛋白濃度很低(10-100Mg/L),就應(yīng)另加隔離蛋白以減少容器對抗體蛋白的吸附,隔離蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。
絕大多數(shù)已稀釋的抗體應(yīng)存在4℃-8℃條件下,以免凍融對抗體蛋白產(chǎn)生有害效應(yīng)??贵w原液和已分離的免疫球蛋白組分應(yīng)保存于-20℃條件下,并避免反復(fù)凍融。冷凍的抗體溶液應(yīng)置于室溫中緩慢地解凍,應(yīng)避免用高溫快速解凍。
被細(xì)菌污染的抗體常會出現(xiàn)假陽性結(jié)果,應(yīng)將污染的抗體溶液及其他試劑棄之。為防止細(xì)菌污染,可于抗體溶液中加入0.01%疊氮鈉??贵w經(jīng)真空冷凍干燥后置-20℃以下可保存3-5年。
保存稀釋后的單抗應(yīng)加入0.1%疊氮鈉濃度。大多數(shù)稀釋抗體可進(jìn)行冷凍保存,少數(shù)抗體可能會丟失抗原活性。大多數(shù)單抗,只要蛋白濃度適當(dāng),可在4℃下保存數(shù)月。 免疫測定的敏感性、特異性、測定所需時間及穩(wěn)定性往往都與抗體的親和常數(shù)、特異性以及穩(wěn)定性等有著直接,因此,對抗體通常也就是從這幾個方面著手。
(一)親和力(affinity)
通??贵w的親和力是指抗體的單個Fab片段對相應(yīng)抗原的單個決定基的特異結(jié)合能力,抗體的親和力越高,則其對相應(yīng)抗原的結(jié)合力越強,反之亦然。而多價抗原和抗體之間的結(jié)合能力則稱為親和力(avidity),此術(shù)語體現(xiàn)了抗原和抗體的價在其結(jié)合反應(yīng)中所起的作用。因此,在親和力的測定和計算中應(yīng)考慮抗原和抗體價的作用。決定抗體親和力除了抗體結(jié)合位點與抗原決定簇的空間構(gòu)型的適合度外,抗體抗原分子間的分子鍵、庫侖引力、范德華引力等也有一定的作用,因此抗體抗原的親和力與反應(yīng)條件如pH也有較大的關(guān)系。
抗體的親和力測定方法較多,如ELISA和固相放射免疫測定(SPRIA)方法等。ELISA由于簡便快速,具有很好的實用性。
方法:ELISA法測定抗體親和常數(shù)。使用ELISA方法測定抗體的親和力,首先要用抗原包被96孔聚丙烯微孔板,然后,在抗原濃度保持不變,在液相狀態(tài)下加入系列不同濃度的抗體反應(yīng),再將此反應(yīng)混合物加入至抗原包被的孑L中,使用約使10%游離抗體被固相抗原吸附的反應(yīng)條件反應(yīng),使得在液相狀態(tài)下抗原抗體所達(dá)成的平衡不至受到破壞,然后從抗原存在和不存在時所測得的吸光度的差異計算游離抗體的比例,這可從吸光度對抗體濃度的校準(zhǔn)曲線的線性部分得到,ELISA測定中,當(dāng)測定顯色吸光度與抗體濃度呈線性相關(guān)時,假定總的抗體濃度已知,則在反應(yīng)平衡時游離抗體濃度可使用下式測定:
nd/Bn=ODd/ODB
其中ODd為一給定的抗原濃度存在時所測得的光密度,ODB為抗原不存在時所測得的光密度,于是結(jié)合的抗體部分。可定義如下:
α= (ODB -ODd)/ ODB
但這只是在將反應(yīng)混合物加入至抗原包被孔中時液相中抗原抗體反應(yīng)平衡沒有出現(xiàn)變動對才成立,如果在抗原包被的孔中只有約10%的游離抗體被子固相抗原捕獲,就不會破壞這種平衡。為驗證這一點,可以將不同已知濃度的抗體加入至包被抗原孔中溫育適當(dāng)?shù)臅r間后,再將各孔中的反應(yīng)物移至另一塊相同包被的板孔中溫育相同的時間,則轉(zhuǎn)移前后加入不同抗體濃度孔中的OD值的差異不應(yīng)超過10%
結(jié)合反應(yīng)的數(shù)據(jù)可以下式表示:
Ny/sc=K(Bn-ny)
使用結(jié)合的抗體部分α,ny和sc的量可表示為:
ny=αBn
sc=As-Bn
α/sc=K(1-α)
即可構(gòu)建。α/sc對α的Scatchard圖,圖上的斜率即為K值。
如果總的抗體結(jié)合位點濃度(Bn)未知,則可通過質(zhì)量作用定律的Klotz公式得到K值。
(二)特異性(specificity)
抗體的特異性關(guān)系到免疫測定的特異性,因此特異性是抗體鑒定的一項極為重要的指標(biāo)。特異性的測定有兩種方法,*種方法是證明特定的抗體對抗原沒有交叉反應(yīng)性,也就是說,除了用來免疫制備抗體的抗原外.,抗體對其他相近抗原沒有可測定的反應(yīng)性。第二種方法是證明在抗體對原始特定抗原的結(jié)合反應(yīng)中,其他相近抗原分子對這種結(jié)合反應(yīng)無干擾作用。
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