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anti-Thioredoxin 1 硫氧還蛋白抗體

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更新時間:2017-05-07 13:02:58瀏覽次數:239次

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抗體儲存容器應由不吸附蛋白質的材料制成,常用的有聚丙烯,聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如儲存的抗體中蛋白濃度很低(10-100Mg/L),就應另加隔離蛋白以減少容器對抗體蛋白的吸附,隔離蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。
絕大多數已稀釋的抗體應存在4℃-8℃條件下,以免凍融對抗體蛋白產生有害效應。抗體原液和已分離的免疫球蛋白組分應保存于-20℃條件下,并避免反復凍融。冷凍的抗體溶液應置于室溫中緩慢地解凍,應避免用高溫快速解凍。
被細菌污染的抗體常會出現假陽性結果,應將污染的抗體溶液及其他試劑棄之。為防止細菌污染,可于抗體溶液中加入0.01%疊氮鈉。抗體經真空冷凍干燥后置-20℃以下可保存3-5年。
保存稀釋后的單抗應加入0.1%疊氮鈉濃度。大多數稀釋抗體可進行冷凍保存,少數抗體可能會丟失抗原活性。大多數單抗,只要蛋白濃度適當,可在4℃下保存數月。 免疫測定的敏感性、特異性、測定所需時間及穩定性往往都與抗體的親和常數、特異性以及穩定性等有著直接,因此,對抗體通常也就是從這幾個方面著手。
(一)親和力(affinity)
通常抗體的親和力是指抗體的單個Fab片段對相應抗原的單個決定基的特異結合能力,抗體的親和力越高,則其對相應抗原的結合力越強,反之亦然。而多價抗原和抗體之間的結合能力則稱為親和力(avidity),此術語體現了抗原和抗體的價在其結合反應中所起的作用。因此,在親和力的測定和計算中應考慮抗原和抗體價的作用。決定抗體親和力除了抗體結合位點與抗原決定簇的空間構型的適合度外,抗體抗原分子間的分子鍵、庫侖引力、范德華引力等也有一定的作用,因此抗體抗原的親和力與反應條件如pH也有較大的關系。
抗體的親和力測定方法較多,如ELISA和固相放射免疫測定(SPRIA)方法等。ELISA由于簡便快速,具有很好的實用性。
方法:ELISA法測定抗體親和常數。使用ELISA方法測定抗體的親和力,首先要用抗原包被96孔聚丙烯微孔板,然后,在抗原濃度保持不變,在液相狀態下加入系列不同濃度的抗體反應,再將此反應混合物加入至抗原包被的孑L中,使用約使10%游離抗體被固相抗原吸附的反應條件反應,使得在液相狀態下抗原抗體所達成的平衡不至受到破壞,然后從抗原存在和不存在時所測得的吸光度的差異計算游離抗體的比例,這可從吸光度對抗體濃度的校準曲線的線性部分得到,ELISA測定中,當測定顯色吸光度與抗體濃度呈線性相關時,假定總的抗體濃度已知,則在反應平衡時游離抗體濃度可使用下式測定:
nd/Bn=ODd/ODB
其中ODd為一給定的抗原濃度存在時所測得的光密度,ODB為抗原不存在時所測得的光密度,于是結合的抗體部分。可定義如下:
α= (ODB -ODd)/ ODB
但這只是在將反應混合物加入至抗原包被孔中時液相中抗原抗體反應平衡沒有出現變動對才成立,如果在抗原包被的孔中只有約10%的游離抗體被子固相抗原捕獲,就不會破壞這種平衡。為驗證這一點,可以將不同已知濃度的抗體加入至包被抗原孔中溫育適當的時間后,再將各孔中的反應物移至另一塊相同包被的板孔中溫育相同的時間,則轉移前后加入不同抗體濃度孔中的OD值的差異不應超過10%
結合反應的數據可以下式表示:
Ny/sc=K(Bn-ny)
使用結合的抗體部分α,ny和sc的量可表示為:
ny=αBn
sc=As-Bn
α/sc=K(1-α)
即可構建。α/sc對α的Scatchard圖,圖上的斜率即為K值。
如果總的抗體結合位點濃度(Bn)未知,則可通過質量作用定律的Klotz公式得到K值。
(二)特異性(specificity)
抗體的特異性關系到免疫測定的特異性,因此特異性是抗體鑒定的一項極為重要的指標。特異性的測定有兩種方法,*種方法是證明特定的抗體對抗原沒有交叉反應性,也就是說,除了用來免疫制備抗體的抗原外.,抗體對其他相近抗原沒有可測定的反應性。第二種方法是證明在抗體對原始特定抗原的結合反應中,其他相近抗原分子對這種結合反應無干擾作用。
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