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ELISA試劑盒的優(yōu)化方案

時間:2014-6-5閱讀:276
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    研究較多的黏附分子主要ELISA試劑盒有免疫球蛋白超家族、整合素家族、選擇性家族、Cadherin家族等。細胞間黏附分子-1(ICAM-1)是黏附分子免疫球蛋白超家族中的一員,由內(nèi)皮細胞、淋巴細胞、單核細胞和上皮細胞表達,其配體是白細胞黏附分子CD18家族中的2個成員:即淋巴細胞功能相關抗原—1[lymphocyte function-associated antigen-1,LFA-l(CDua/CDls)]和巨噬細胞抗原復合體-1[Mac-1(CD11a/CD18)]。正常肝組織中僅竇周細胞、門靜脈血管內(nèi)皮細胞有少量ICAM-1表達,肝細胞和膽管上皮細胞多為陰性。炎癥反應過程中,ICAM-1是細胞與細胞、細胞與細胞外基質(ECM)接觸過程中起中心作用的一種細胞黏附分子,而炎癥細胞表面的LFA-1與靶細胞膜上的ICAM-1結合是*的過程。近年來,白介素ELISA試劑盒許多研究表明:ICAM-1與LFA-l介導的細胞間黏附,與肝細胞壞死的發(fā)生有十分密切的關系,而阻斷它們之間的相互作用或干擾它們的表達可能成為阻止肝細胞發(fā)生壞死的一種成功策略。由于ICAM-1與病毒性肝炎關系的研究是近年來肝病研究領域的新熱點,檢測方法和正常參考值的確立尚待完善。

ELISA試劑盒[檢測步驟]
1.使用前先混勻所有試劑,應注意避免起泡。
2.確定好空白、標準及待測所需孔數(shù)(每一份標本、標準品、空白及隨機選擇的對照應測兩次)。
3.從已平衡至室溫的密封袋中取出所需的板條,洗板。
4.加樣,在空白孔、標準品孔中加入100u1樣品稀釋液,在待測孔中加入90u1樣品稀釋液。
5.每份標本取10ul加入待測孔中,混勻。
6.在所有孔中加入50ul已稀釋的HRP結合物,用封板膠紙封住反應孔,置于100rpm搖床上室溫環(huán)境中(18~25℃)孵育1h,洗板。
7.在所有孔中加入100ul TMB底物稀釋液,包括空白孔。置于100rpm搖床上,避光室溫環(huán)境中(18~25℃)孵育約10min(視顯色深淺靈活掌握)。
8.加入終止液(100u1/孔)終止反應,混勻后即刻測量OD450值。
注意:若孵育時未使用搖床則所獲OD值較低,但仍然有效。
ELISA試劑盒[注意事項]
1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出時應在室溫環(huán)境中平衡30rain后方可使用,未用完的微孔條用自封袋密封保存。
2.酶標板洗滌時各孔均需加滿洗滌液,防止孔內(nèi)有游離酶不能洗凈。應設定30~60s的洗滌浸泡時間。
3.滴加試劑前應將滴瓶翻轉數(shù)次,使液體混勻。滴加時瓶身應保持垂直,以使滴量準確。
4.所有樣品和廢棄物都應按傳染源處理。終止液為2mol/L硫酸,使用時應注意安全。
5.每批樣本應同時做標準曲線。
6.若標本OD值在標準曲線測定范圍以外,應適當稀釋后重測。

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