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上海金穗生物科技有限公司
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體外DNA重組的技術要點

時間:2012-12-15閱讀:114
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1 油的覆蓋及反應體系的體積
如果PCR儀不加熱反應小管的管蓋,你需要在反應混合物上覆蓋密度小的礦物油以防止蒸發。在反應小管的管蓋總是被加熱到高于96℃的PCR儀中,可以不加礦物油進行PCR反應。油覆蓋得不充分會導致蒸發,這將導致更高的反應濃度,并使得溫度降低。在大部分應用情況下,70ul油對于100ul反應體系、40ul油對于50ul反應體系及30ul油對于25ul反應體系是大致充足的。過多的油會影響熱傳遞。要注意始終使用合適的油量。

2 試劑質量的控制
DNA聚合酶本來就不穩定(如對起泡及高溫條件),總是需要在一20℃保存并在冰上使用。脫氧三磷酸腺苷也是熱不穩定的,其儲液必須分裝保存在一20℃,避免反復冰凍及解凍。氯化鎂在長期保存后可能形成沉淀,其儲液必須分裝保存在一20℃,避免反復冰凍及解凍。

3 瓊脂糖凝膠電泳
常常使用瓊脂糖凝膠電泳來對DNA片段進行分析并按大小區分開來。線性DNA分子的有效分離范圍是:在2%(w/v)瓊脂糖凝膠中為o.1—3kpb,在1.5%(w/v)瓊脂糖凝膠中為0.2—4kpb,在1.2%(w/v)瓊脂糖凝膠中為0.4—6kpb,以及在0.9%(w/v)瓊脂糖凝膠中為0.5~7kpb。為了分離在DNA改組中常用的短DNA片段(50~300bp),常用的濃度(0.8%一1.2%)可能不能很好地起作用。

常常很難在瓊脂糖凝膠中看到短DNA片段。在使用較長波長(如366nm)的紫外燈的預實驗中,這一點尤其成問題。另外,上樣緩沖液[10X上樣緩沖液:50%(體積分數)甘油、0.1%(w/v)溴酚藍、0.1%(w/v)二甲苯腈(xylene cyanol)]中的示蹤染色試劑也可能掩蓋DNA發出的熒光(在0.5%~1.4%的瓊脂糖凝膠中,溴酚藍的遷移率為約300bp,二甲苯腈的遷移率為約4000bp)。為達到理想的透明度,可以在甘油中稀釋上樣緩沖液直到它們微微可見為止。或者對樣品使用無染色試劑的上樣緩沖液,并在空的泳道中加入染色試劑以監控遷移。

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