因為抗原在細胞染色時需先固定，所以，抗體與抗原的結合比在溶液中結合需要更長的時間。孵育的時間可以根據實驗設計進行相應調整，但是產生有效結合的時間一般須超過30min。通過增加二抗濃度可以縮短孵育時間。通常一些折衷辦法可使二者兼頤。產生強烈的信號往往伴有高背景的問題。低濃度試劑產生的背景雖較低，但信號的強度也相應較弱。一般推薦選擇相對較短的時間進行二抗的孵育（30～60min），并應對標記二抗進行滴度測定，使其產生較低背景并形成可接受的信號強度。總之，抗體應該用含高濃度非特異性蛋白的緩沖液稀釋。一般使用牛血清白蛋白（BSA）、胎牛血清（FBS）和脫脂奶粉，或者與標記抗體相同種屬的正常血清。
1．對照
特異性染色反應應與對照進行比較。地評價一種染色模式，應該比較來自相同種屬的兩種抗體。對多克隆抗體來說，的對照是制備特異性抗體的同一動物的免疫前采集的血清，但是，在多數情況下，相同種屬動物的非免疫血清也可以采用。對單克隆抗體而言，對照必需是和特異性抗體的來源相同，即細胞培養上清與上清對比，小鼠腹水與腹水對比，或者純化抗體與純化抗體相對應。如果可能，對照抗體應該是特異性抗體的同類或亞類。來自親代的骨髓瘤細胞培養上清是不適宜的對照，因其不含抗體。但來自美國典型培養收藏中心（theAmericantypeculturecollection，ATCC）的適當對照雜交瘤細胞系是有效的。此外，如果使用間接測定法，二級試劑亦應經過檢測。當使用酶標檢測法時，應該做未加任何抗體的酶反應對照，以證實某些內源性酶反應的存在與定位。
2．準備
對抗體的結合和觀察重要的準備工作是對一抗和二抗進行效價的測定。調整加入的一抗和二抗的用量，使之能得到有效強度的信號，而非特異染色較低。一般通過系列稀釋各種抗體來得到這種效果（通常用含蛋白的緩沖液如3％BSA／PBS），并在靶細胞株同時進行實驗觀察。1：3稀釋可以很快得出一個合理的結果。對各種一抗的準備，效價滴定試驗應該重復進行。而對二抗效價滴定后，就可以作為該抗體的使用標準。
3．需要的溶液和試劑
一抗、二抗（多數為商品來源）、PBS和3％／BSA／PBS。
4．操作步驟
（1）將組織切片或細胞涂片置于濕盒中。
（2）加入一抗，所有的稀釋必須用含蛋白的溶液。例如，含3％BSA的PBS。單抗一般是雜交瘤細胞培養上清（特異性抗體濃度一般用20～50ul／ml）。小鼠腹水，純化的單抗和多抗，粗制的多抗血清應該在特異性抗體濃度為0．1～long／m1稀釋范圍內檢測。如果特異抗體濃度是未知的，則將初始材料做1：10，1：100，1：1000，1：10 000稀釋。
（3）將標本片置濕盒中，室溫孵育至少30min。對某些抗原抗體反應，延長孵育時間至24h，可以增加其敏感性。
（4）用PBS洗滌，換液3次，每次>5min。此緩沖液可以補加1％TritonX-100或NP-40，有助于解決背景問題。
（5）加入標記的二抗。二抗必須用含有蛋白的溶液如3％／BSA／PBS或1％免疫球蛋白／PBS（來自檢測試劑的相同種屬）進行稀釋。常用的二級試劑包括酶或膠體金標記的抗免疫球蛋白抗體、蛋白A和蛋白G。
酶標試劑如果使用商品，檢測時二抗的稀釋范圍在1：50～1：1000。堿性磷酸酶標記的試劑應該用Tris緩沖液稀釋，不可用PBS。
金標試劑用PBS洗滌金溶膠顆粒。用含1％明膠的PBS稀釋后加至標本上。
（6）將加標記二抗的標本片放于濕盒中，在室溫至少孵育20min。對于金標試劑，應定期在顯微鏡下觀察直至獲得滿意信號。
（7）更換PBS，漂洗3次，每次5min。
至此，標本片即可用于檢測。
5．常見的問題
如果發現背景較深，常為非特異性結合所致，可以用含蛋白液體預先孵育標本而加以抑制。
一般使用的蛋白溶液是3％BSA，10％FBS（胎牛血清，因只含有低濃度的IgG），10％干奶粉或者來自與檢測試劑相同種屬的純抗體（1％）。阻斷蛋白可以加在各種抗體的準備階段，也可以在加入抗體前預先孵育標本。
