酶聯免疫吸附試驗（ELISA）

1.分類和操作原理
       酶聯免疫吸附試驗或稱酶聯免疫吸附測定法。是當前應用zui廣泛的一種測定方法，它是以物理方法將抗體（或抗原）吸附在固相載體上，隨后的一系列免疫學和生物化學反應都在此固相載體上進行，免疫酶測定試驗包括間接法、雙抗體夾心法和競爭法以及近年來發展的一些改良法。
（1）間接法：將已知抗原吸附（或稱包被）于固相載體，孵育后洗去未吸附的抗原，隨后加入含有特異性抗體的被檢血清，感作后洗除未起反應的物質，加入酶標抗體同種球蛋白（如被檢血清是兔血清，就需用抗兔球蛋白），感作后再經洗滌，加入酶底物，底物被分解，出現顏色變化，顏色變化的速度及程度，與樣品中的抗體量有關，即樣品含有抗體愈多，顏色出現得也愈快、愈深。
（2） 雙抗體夾心法：是檢測抗原的方法，將特異性免疫球蛋白吸附于固相載體表面，然后加入含有抗原的溶液，使抗原和抗體在固相表面上形成復合物。洗除多余的抗原，再加入酶標記的特異性抗體，感作后漂洗，加入酶底物，顏色的改變與待測樣品中的抗原量成正比。
（3）競爭法：利用酶標記抗原和未標記抗原共同競爭有*抗體的原理，測定樣品中的抗原。操作時需要有只加酶標記抗原的系統作為對照。將抗體吸附于固相載體表面，感作后漂洗，加入待檢抗原樣品和酶標記抗原（也可先加待檢樣品，稍后再加酶標記抗原）。對照則只加酶標記抗原。感作后漂洗加入酶底物溶液。含酶標記抗原的對照系統出現顏色反應。而在待檢系統中，由于樣品中未標記抗原的競爭作用，相應抑制顏色反應。待檢抗原含量高時，其對抗體的競爭能力強，所形成的不帶酶的抗原抗體復合物量亦多，帶酶復合物的形成量相對減少，從而使酶催化底物時產生有色產物的量也減少，而帶酶復合物量卻相對增多，酶催化底物時產生有色產物的量也增多。因此，待檢系統中顏色變化的程度與其中抗原的含量成負相關。
此外，免疫酶染色法中抗酶染色法的免疫球蛋白橋法和PAP法等也都可以用于酶聯免疫吸附測定，除以上這些基本方法之外，科學工作者又在此基礎上，通過“技術雜交”設計出了許多改良方法，舉例如下：
阻斷ELISA：將已知抗原包被于固相載體，孵育后洗去未吸附的抗原，隨后加入被檢血清，感作后洗去未起反應的物質，加入抗已知抗原的酶標抗體。感作后再洗滌，加入酶底物，底物顏色變化的速度與程度，與被檢血清中的抗體量有關，樣品中含有的抗體愈多，與固相載體上抗原結合得愈多，剩下給已知抗體結合的位點愈少，顏色出現的愈慢、愈淺。
夾心間接ELISA：本法主要應用酶標記抗抗體測定抗原。先將特異性抗體（如兔IgG）吸附于固相載體表面，孵育后沖洗，隨后加入待檢抗原樣品，感作后沖洗。再加入不同種動物（如豚鼠）的相同的特異性抗體。感作沖洗后，加入酶標記抗第二種抗體的動物球蛋白（如兔抗豚鼠免疫球蛋白）。再行感作沖洗后，加入酶的底物。其所產生的顏色變化與第二步中加入的抗原量成正相關。由于預先吸附在固相載體表面的抗體能夠特異性地捕捉標本中的抗原，所以，這種方法又稱為抗原捕捉ELISA（AC—ELISA）。
抗體捕捉ELISA：主要應用于IgM的檢測。它可以解決由于IgM在液體中含量較低，用常規間接法測定常不能獲得滿意效果的問題。抗體捕獲ELISA的操作原理是：首先用抗u鏈抗體（是單抗）包被載體，隨后加入待檢體液（血清或腦脊髓液等），感作后沖洗，再加入酶標抗原或抗原～酶標抗體復合物，再行感作沖洗后，加入酶的底物。反應產生的顏色變化與體液中的特異性IgM含量成正比。
一步法ELISA  ：本法是雙抗體夾心法的拓展，其基礎是分別使用針對不同抗原決定簇的單克隆抗體包被載體和進行酶標記。具體方法是用針對待檢抗原不同抗原決定簇的一種或幾種單克隆抗體包被載體，包被完畢的載體經適當處理可長期保存或作商品供應。檢測時，同時加入被檢標本和酶標記的針對待檢抗原的另一種或幾種抗原決定簇的單克隆抗體，感作后沖洗，再加入酶作用的底物，反應所產生的顏色變化與待檢抗原的含量成正比。本法由于待檢抗原和酶標抗體同時一步加入，故稱一步法，其優點是操作十分快捷，一般可在1小時內得出結果，某些商品化的一步法ELISA系統，整個檢測只需幾分鐘。
2.ELISA的操作要領
（1）固相載體的選擇：目前廣泛應用的固相載體是聚苯乙烯微量反應板，有的供應商還把聚苯乙烯制成條或小杯，可隨意組合應用。另一種廣泛應用的固相載體是PVC塑料軟板。這些材料的吸附效果與塑料的類型、表面性質有關，生產加工工藝的不同以及其他選擇性能好的固相載體。吸附性能可用以下方法測定：在固相載體的每一個小孔中，加入同一份同一稀釋度的抗原或抗體，使之吸附于小孔表面，然后按常規方法操作，加底物顯色后測定每一孔中溶液的A值。一般認為，每兩空的A值誤差均在±10％內，否則不可使用。
固相載體用標準陰、陽性抗體或抗原孔的光密度差值要大，二者相差10倍以上屬合格。
近年來，還有一些研究人員應用硝酸纖維素膜作為ELISA的載體，直接在膜上點樣，進行一系列的操作，結果表明這種載體使用方便，敏感性、特異性等并不亞于用塑料作載體的ELISA試驗，由此衍生出了斑點—ELISA（Dot—ELISA）。還有人用疏水聚酯布作為ELISA載體，使ELISA結果更易保存，由此衍生出了布—ELISA（C—ELISA）。
（2）預備試驗：在正式進行ELISA試驗前，必須進行預試驗以確定酶結合物，包被抗原或抗體的zui適濃度、底物的zui適反應時間等。
酶結合物的確定：以pH9.6的碳酸鹽緩沖液將IgG稀釋至100ug／ml，加入固相載體的每一孔中進行包被，洗滌后將酶結合物以1：200、1：400、1：800、……作系列稀釋，依次加入各孔，每一稀釋度加2孔。反應完畢后加底物顯色，讀取結果，以能產生光吸收值（A）為1.0的稀釋度為結合物的zui適濃度。
包被蛋白質濃度的確定：酶結合物濃度確定后，應測定包被蛋白質（抗體或抗原）的zui適濃度。其步驟是：將欲被包被的蛋白質用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作1：10、1：20、1：40……系列稀釋，以每一稀釋度包被固相載體的2個孔，然后進行常規的ELISA操作。zui后讀取結果，同樣以能產生光吸收值（A）為1.0的稀釋度為包被蛋白質的zui適濃度。
底物zui適作用時間的確定：以zui適稀釋度抗原和酶結合物進行試驗，加入底物后在不同時間終止反應，即可確定zui適反應時間。
（3）包被：將蛋白質（抗原或抗體）吸附于固相載體表面的過程稱為包被。除應注意選擇合適的載體外，還應注意：
包被液的pH：通常用pH9.5～9.6，0.05mol／L或0.1mol／L的碳酸鹽緩沖液稀釋抗原或抗體，吸附時的pH一般為9.0左右。如pH較低，則吸附時間延長，但pH低于6.0則非特異性吸附增加。
吸附時間與溫度：一般為4℃過夜，有時也可采用37℃吸附1～5小時。
蛋白質液：在固相載體上，每孔加入量一般為0.1～100ug／ml。若濃度太高，會因抗原或抗體蛋白分子之間的相互作用較大而影響載體對蛋白質的吸附；如濃度太低，則敏感性下降。
對于細胞培養產生的病毒抗原，或其他高濃度抗原，也可試用下述方法進行包被，將細胞培養物或其他抗原液加入反應板的各孔后，每孔滴入1滴20％～25％的甲醛溶液，室溫固定15分鐘，其間不斷溫和地晃動。zui后用洗滌液或蒸餾水洗滌除去甲醛，包被即告完成，該法簡便省時，包被效果確實。
（4）洗滌：在ELISA試驗過程中，與免疫酶染色法一樣，為了除去前一步所加的未結合的抗原、抗體或結合物，防止其與隨后加入的相應物質或底物產生不應有的反應，則每一步都必須進行洗滌（清洗）。其方法是，先將載體各孔甩干，再加洗滌液充滿各孔，靜置3～5分鐘，如此重復三次。然后將載體甩干，立即加入下一步的試劑。
目前較多使用的洗滌液是含有0.05％吐溫-20，0.01mol／LpH7.4的PBS。應用含有0.05％吐溫-20，0.01mol／LpH7.4的Tris—HCl效果也很好。
（5）封閉：抗原或抗體包被后，載體表面仍可能有未吸附蛋白質的空白位點，從而造成下一步的非特異性吸附，即使用較高濃度的蛋白質包被，也有必要對包被后的載體進行處理，以封閉可能存在的空白位點。常用的封閉液有：1％～3％牛血清白蛋白、3％～5％脫脂乳、10％牛或馬血清等。加入封閉液后，可在37℃吸附2小時，然后洗滌。
（6）結果判定：ELISA結果的判定方法很多，常用的有以下幾種：
目視比色法：在ELISA試驗完成后，直接以肉眼觀察反應產物的顏色變化，作出陰性或陽性的判斷。這種方法主要用于ELISA的定性實驗中。
光電比色法：用分光光度計在適宜的波長下測定反應后的光密度值，然后以下列方法之一對樣品進行定性或定量：
a．值法：在小心控制的條件下，結果以值來表示。在抗體測定中，先確定未感染群體的值平均值（X），然后在此水平上選擇一個指示感染值（一般是X±2SD或X±3SD），如果被檢血清的值在該值之上，為陽性；在其下，為陰性。
b．P／N比法：即被檢樣品（P）的光吸收值（A）和陰性標準樣品（N）平均（A）值之比，以大于某一比值（一般為≥2）為陽性。
c．終點法：所有血清通過連續稀釋滴定，并測定每一稀釋度的A值，根據陰性血清的測定結果，選定一個值（見值法），以產生這個值的稀釋倍數作為“效價”。
d．單稀釋法：被檢樣品不作連續稀釋，而根據預試驗的結果選擇一個合適的稀釋度。所有樣品都按該稀釋度稀釋，反應后測定光吸收值，將此值與用標準樣品作成的標準曲線比較，或用回歸方程計算，得出被檢樣品的“效價”。有人將這種方法稱為單稀釋ELISA。

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