*酰基轉移酶(Acyl-coenzyme A:cholesterolacyltransferase，ACAT)是細胞內*催化游離*和長鏈脂肪酸合成*酯的酶，在體內*代謝平衡過程中起到關鍵的調控作用。細胞內ACAT活性與細胞膜微結構域功能、高*血癥、動脈粥樣硬化早期病變泡沫細胞形成等直接相關。因此，上普遍認為ACAT及其功能作用過程是重要的藥靶系統。在實驗室研究積累的基礎上，我的博士論文工作主要探索人ACATl表達在RNA水平的調控與在細胞水平的功能。
　　 實驗室前期工作表明，人ACATl低活性56-kD和高活性50-kD異構體分別從其mRNA的GGC1274-1276和AUG1397-1399密碼子起始產生，而此對應于cDNA K1的mRNA含有可選擇性長5’-非翻譯區序列(5’-UTR,It1-1396)。本工作主要是探索來源于人7號和1號兩條染色體的該5'-UTR序列對ACATl mRNA穩定性和蛋白表達的影響。首先，構建含有不同長度5'-UTR序列的人ACATl基因及其N端產物編碼序列與熒光素酶基因的表達質粒并轉染AC29細胞，分別用Western blot和RT-qPCR檢測相應的蛋白表達和mRNA量。結果顯示，人ACATl mRNA的可選擇性長5'-UTR能非常顯著降低ACAT150-kD異構體及其N端產物與熒光素酶蛋白的表達，同時非常顯著降低其mRNA的量，且長5'-UTR對mRNA穩定性的影響遠大于對翻譯效率的影響。接著，利用ActD處理轉染的細胞，抑制轉錄活性的結果顯示，人ACATl mRNA的可選擇性長5'-UTR明顯促進其mRNA的降解。進而，制備體外轉錄的RNA分別進行細胞質轉染和細胞核轉染的實驗結果顯示，在細胞核內和細胞質中，含有長5'-UTR的mRNA降解速率都比不含長5'-UTR的快。這些結果說明，人ACATl mRNA的長5'-UTR主要通過促進其mRNA decay而調控ACATl表達。進一步，通過含有長5'-UTR中7號和1號染色體來源序列缺失突變的質粒轉染細胞進行一系列實驗，揭示了7號染色體來源序列促進其mRNA快速降解、1號染色體來源序列反而增強其mRNA的穩定性的decay機制。這部分研究工作，為人ACATl mRNA轉錄后的跨染色體剪接及其調控機制提供了新認識，也可為ACAT精細調節人細胞*代謝平衡研究提供重要的分子基礎。
　　 在包括上述ACAT1分子水平調控等研究基礎上，利用無明顯ACAT2表達的神經細胞，深入探索ACAT1活性引起其底物游離*變化的功能。首先，利用ACAT抑制劑CP-113818處理神經細胞SK-N-SH，Filipin染色和細胞質膜游離*測定的結果均顯示，ACAT1活性抑制引起細胞質膜游離*量顯著增高，具有時間和劑量依賴性。同時，用Western blot檢測細胞質膜APPα-型加工產物sAPPα的結果顯示，ACAT1活性抑制引起APPα-型加工減少，也具有時間和劑量依賴性。并且利用CDX depletion細胞質膜*的結果證實，ACAT1抑制引起細胞質膜游離*量提高而導至APPα-型加工減少。以上結果表明，ACAT1引導神經細胞質膜游離*量而影響APPα-型加工。深入利用LPPS和Lova抑制細胞*的吸收、外運與合成代謝的結果顯示，在細胞*較低水平條件下，ACAT1活性抑制仍能提高細胞質膜游離*量；而且在此條件下利用LDL或Mev增加細胞*的吸收或合成，也均無明顯影響ACAT1引導質膜*量的變化。這些表明，ACATl引導神經細胞質膜游離*量具有很強的特異性和發揮重要功能作用。進一步，通過利用化合物U18666A抑制*轉運至細胞質膜的NPC依賴途徑等深入實驗，發現ACAT1活性引導細胞質膜*量，還通過非NPC依賴的*轉運途徑。深入通過ACAT1的RNAi和過表達及胚腦組織培養等實驗，證實了人ACAT1表達調控可引導神經細胞質膜游離*量而發揮其在細胞水平的功能作用。這部分工作，建立了一種ACAT1表達的細胞水平功能研究新體系，可促進拓展ACAT引導細胞質膜游離*的動態變化等前沿性探索。