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人單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)ELISA 檢測試劑盒說明書

時間:2010-10-16閱讀:457
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人 (Human)單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)ELISA 檢測試劑盒
本試劑僅供研究使用  標(biāo)本:血清或血漿


試驗原理:
MCP-1試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(ELISA).已知MCP-1濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測。先將MCP-1和*標(biāo)記的抗體同時溫育。洗滌后,加入親和素標(biāo)記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌,去除未結(jié)合的酶結(jié)合物,然后加入底物A、B,和酶結(jié)合物同時作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中MCP-1的濃度呈比例關(guān)系。

試劑盒內(nèi)容及其配制:
試劑盒成份 96孔配置 48孔配置
96/48人份酶標(biāo)板 1塊板(96T) 半塊(48T)
塑料膜板蓋 1塊 半塊
標(biāo)準(zhǔn)品:800pg/ml 1瓶(1.0ml) 1瓶(0.5ml)
空白對照 1瓶(1.0ml) 1瓶(0.5ml)
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液 1瓶(8.0ml) 1瓶(4.0ml)
*標(biāo)記的抗MCP-1抗體 1瓶(8.0ml) 1瓶(4.0ml)
親和鏈酶素-HRP 1瓶(12ml) 1瓶(6.0ml)
洗滌緩沖液 1瓶(20ml) 1瓶(10ml)
底物A 1瓶(6.0ml) 1瓶(3.0ml)
底物B 1瓶(6.0ml) 1瓶(3.0ml)
終止液 1瓶(6.0ml) 1瓶(3.0ml)

自備材料:

1. 蒸餾水。
2. 加樣器:5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。
3. 振蕩器及磁力攪拌器等。
4. 
樣品收集、處理及保存方法:

1、 血清-----操作過程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后,1000×g離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
  
2、 血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
3、 細(xì)胞上清液---1000×g離心10分鐘除顆粒和聚合物。
4、 組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘,取上清液
5、 保存------如果樣品不立即使用,應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存,避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒,檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

操作注意事項:

? 試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲存,使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄,不可保存。
? 實(shí)驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中,密封保存,以免變質(zhì)。
? 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
? 使用一次性的吸頭以免交叉污染,吸取終止液和底物A、B液時,避免使用帶金屬部分的加樣器。
? 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
? 底物A應(yīng)揮發(fā),避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感,避免長時間暴露于光下。避免用手接觸,有毒。實(shí)驗完成后應(yīng)立即讀取OD值。
? 加入試劑的順序應(yīng)一致,以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。
? 按照說明書中標(biāo)明的時間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。


安全性:

1. 避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體,請盡快用水沖洗。
2. 實(shí)驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
3. 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

試劑的準(zhǔn)備:

1. 標(biāo)準(zhǔn)品:標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實(shí)驗時準(zhǔn)備,不能儲存。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進(jìn)行:
800
 pg/ml (6號標(biāo)準(zhǔn)品) 原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。
400
pg/ml (5號標(biāo)準(zhǔn)品) 100ul的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
200
pg/ml (4號標(biāo)準(zhǔn)品) 100ul的5號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
100
pg/ml (3號標(biāo)準(zhǔn)品) 100ul的4號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
50
pg/ml (2號標(biāo)準(zhǔn)品) 100ul的3號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
25 pg/ml (1號標(biāo)準(zhǔn)品) 100ul的2號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
0 pg/ml (空白對照) 原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

2. 洗滌緩沖液(50×)的稀釋:蒸餾水50倍稀釋。

試劑盒性能:

1. 靈敏度:zui小的檢測濃度小于1號標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。
2. 特異性:不與其它細(xì)胞因子反應(yīng)。
3. 重復(fù)性:板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。

  
操作步驟:

1. 使用前,將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫,以免加樣時加入大量的氣泡,產(chǎn)生加樣上的誤差。
2. 根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定,能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。
3. 加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的*標(biāo)記的抗體。蓋上膜板,輕輕振蕩混勻,37℃溫育45分鐘。
4. 甩去孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復(fù)此操作4次。如果用洗板機(jī)洗滌,洗滌次數(shù)增加一次。
5. 每孔加入100ul的親和鏈酶素-HRP,輕輕振蕩混勻,37℃溫育30分鐘。
6. 甩去孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復(fù)此操作4次。如果用洗板機(jī)洗滌,洗滌次數(shù)增加一次。
7. 每孔加入底物A、B各50ul,輕輕振蕩混勻,37℃溫育5分鐘。避免光照。
8. 取出酶標(biāo)板,迅速加入50ul終止液,加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。
9. 在450nm波長處測定各孔的OD值。

結(jié) 果 判 斷 與 分 析:

1、儀器值:于波長450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值
2、以吸光度OD值為縱坐標(biāo)(Y),相應(yīng)的MCP-1標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X),做得相應(yīng)的曲線,樣品的MCP-1含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度, 再乘以稀釋倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實(shí)際濃度。
3、檢測值范圍:0-800pg/ml
4、敏感度: 1.0 pg/ml


 

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