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牛*(Cortisol)ELISA 檢測試劑盒說明書

時間:2010-10-13閱讀:219
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牛(Cattle) *(Cortisol)ELISA 檢測試劑盒
本試劑僅供研究使用  標本:血清或血漿


試驗原理:
Cortisol試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA).已知Cortisol濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內進行檢測。先將Cortisol和*標記的抗體同時溫育。洗滌后,加入親和素標記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌,去除未結合的酶結合物,然后加入底物A、B,和酶結合物同時作用。產生顏色。顏色的深淺和樣品中Cortisol的濃度呈比例關系。

試劑盒內容及其配制:
試劑盒成份 96孔配置 48孔配置
96/48人份酶標板 1塊板(96T) 半塊(48T)
塑料膜板蓋 1塊 半塊
標準品:800ng/ml 1瓶(1.0ml) 1瓶(0.5ml)
空白對照 1瓶(1.0ml) 1瓶(0.5ml)
標準品稀釋緩沖液 1瓶(8.0ml) 1瓶(4.0ml)
*標記的抗Cortisol抗體 1瓶(8.0ml) 1瓶(4.0ml)
親和鏈酶素-HRP 1瓶(12ml) 1瓶(6.0ml)
洗滌緩沖液 1瓶(20ml) 1瓶(10ml)
底物A 1瓶(6.0ml) 1瓶(3.0ml)
底物B 1瓶(6.0ml) 1瓶(3.0ml)
終止液 1瓶(6.0ml) 1瓶(3.0ml)

自備材料:

1. 蒸餾水。
2. 加樣器:5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。
3. 振蕩器及磁力攪拌器等。
4. 
樣品收集、處理及保存方法:

1、 血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內毒素的試管。收集血液后,1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
  
2、 血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
3、 細胞上清液---1000×g離心10分鐘除顆粒和聚合物。
4、 組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘,取上清液
5、 保存------如果樣品不立即使用,應將其分成小部分-70 ℃保存,避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒,檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

操作注意事項:

? 試劑應按標簽說明書儲存,使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄,不可保存。
? 實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中,密封保存,以免變質。
? 不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。
? 使用一次性的吸頭以免交叉污染,吸取終止液和底物A、B液時,避免使用帶金屬部分的加樣器。
? 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
? 底物A應揮發(fā),避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感,避免長時間暴露于光下。避免用手接觸,有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。
? 加入試劑的順序應一致,以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。
? 按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。


安全性:

1. 避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體,請盡快用水沖洗。
2. 實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
3. 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

試劑的準備:

1. 標準品:標準品的系列稀釋應在實驗時準備,不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行:
800
 ng/ml (6號標準品) 原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。
400
ng/ml (5號標準品) 100ul的原倍標準品加入100ul的標準品稀釋液
200
ng/ml (4號標準品) 100ul的5號標準品加入100ul的標準品稀釋液
100
ng/ml (3號標準品) 100ul的4號標準品加入100ul的標準品稀釋液
50
ng/ml (2號標準品) 100ul的3號標準品加入100ul的標準品稀釋液
25 ng/ml (1號標準品) 100ul的2號標準品加入100ul的標準品稀釋液
0 ng/ml (空白對照) 原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

2. 洗滌緩沖液(50×)的稀釋:蒸餾水50倍稀釋。

試劑盒性能:

1. 靈敏度:zui小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R值為0.990。
2. 特異性:不與其它細胞因子反應。
3. 重復性:板內、板間變異系數(shù)均小于10%。

  
操作步驟:

1. 使用前,將所有試劑充分混勻。不要使液體產生大量的泡沫,以免加樣時加入大量的氣泡,產生加樣上的誤差。
2. 根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定,能使用復孔的盡量做復孔。
3. 加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內。立即加入50ul的*標記的抗體。蓋上膜板,輕輕振蕩混勻,37℃溫育45分鐘。
4. 甩去孔內液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復此操作4次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數(shù)增加一次。
5. 每孔加入100ul的親和鏈酶素-HRP,輕輕振蕩混勻,37℃溫育30分鐘。
6. 甩去孔內液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復此操作4次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數(shù)增加一次。
7. 每孔加入底物A、B各50ul,輕輕振蕩混勻,37℃溫育5分鐘。避免光照。
8. 取出酶標板,迅速加入50ul終止液,加入終止液后應立即測定結果。
9. 在450nm波長處測定各孔的OD值。

結 果 判 斷 與 分 析:

1、儀器值:于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值
2、以吸光度OD值為縱坐標(Y),相應的Cortisol標準品濃度為橫坐標(X),做得相應的曲線,樣品的Cortisol含量可根據(jù)其OD值由標準曲線換算出相應的濃度, 再乘以稀釋倍數(shù);或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實際濃度。
3、檢測值范圍:0-800ng/ml
4、敏感度: 1.0 ng/ml


 

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