弗氏鏈霉菌及耐熱鏈霉菌

               *是一種重要泰樂(lè)菌素的衍生物，合成方法是通過(guò)水解泰樂(lè)菌素得到脫紅霉糖泰樂(lè)菌素（desmycosin），然后以desmycosin為前體，通過(guò)胺化作用在泰樂(lè)菌素內(nèi)酯環(huán)的C-20位置上加上一個(gè)3，5-二甲基哌啶基而成。泰樂(lè)菌素合成基因簇中紅霉糖糖基轉(zhuǎn)移酶合成基因tylCV的中斷會(huì)導(dǎo)致desmycosin的累積。本研究結(jié)合SOE-PCR技術(shù)和PCR-targeting技術(shù)，建立了一種新的鏈霉菌快速基因中斷方法。以泰樂(lè)菌素工業(yè)生產(chǎn)菌株BIB1028為出發(fā)菌株，首先通過(guò)SOE-PCR技術(shù)構(gòu)建tylCV基因中斷結(jié)構(gòu)，將oriT-aac（3）Ⅳ中斷盒按開(kāi)放閱讀框*置換tylCV基因，然后通過(guò)弗氏鏈霉菌—大腸桿菌屬間接合轉(zhuǎn)移將該中斷結(jié)構(gòu)導(dǎo)入BIB1028，通過(guò)同源重組置換tylCV基因，得到重組突變株BIB715。通過(guò)nested-PCR對(duì)tylCV基因置換進(jìn)行了驗(yàn)證，搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示tylCV基因中斷導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)物主要為desmycosin。通過(guò)FLP重組酶作用于tylCV基因中斷結(jié)構(gòu)中的FRT位點(diǎn)，得到tylCV發(fā)生讀碼框缺失的基因置換結(jié)構(gòu)，將該置換結(jié)構(gòu)插入接合轉(zhuǎn)移載體pBIB1015，通過(guò)弗氏鏈霉菌—大腸桿菌屬間接合轉(zhuǎn)移將該基因置換結(jié)構(gòu)導(dǎo)入BIB715，通過(guò)同源重組得到tylCV基因發(fā)生讀碼框缺失的重組突變株BIB1209。

                  通過(guò)PCR、RT-PCR對(duì)置換結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示主要發(fā)酵產(chǎn)物亦為desmycosin。搖瓶菌種篩選以后，在5L發(fā)酵罐上對(duì)出發(fā)菌株BIB1028和兩突變株BIB715和BIB1209進(jìn)行了發(fā)酵試驗(yàn)，參照泰樂(lè)菌素的發(fā)酵工藝，desmycosin的產(chǎn)量分別達(dá)到7.3g／l和7.0g／l，相比出發(fā)菌株的9.1g／l，通過(guò)折算，兩突變株的產(chǎn)能達(dá)到出發(fā)菌株的106±5％。而且和出發(fā)菌株的四種組分（泰樂(lè)菌素A、脫紅霉糖泰樂(lè)菌素B、大霉素C和雷洛菌素D）相比，兩重組突變株的組分主要有兩種（desmycosin和lactenocin），通過(guò)提取后，desmycosin能夠占到總產(chǎn)量的95％，組分更加單一。

                  我們還對(duì)*的合成方法進(jìn)行了探討，與傳統(tǒng)合成以泰樂(lè)菌素成品—磷酸泰樂(lè)菌素為出發(fā)原料相比，本研究中所得重組突變株通過(guò)發(fā)酵得到的desmycosin只需要經(jīng)過(guò)兩三步簡(jiǎn)單處理就可以將90％以上的desmycosin轉(zhuǎn)移至有機(jī)相進(jìn)行*的合成。與傳統(tǒng)泰樂(lè)菌素的70～80％回收率相比，不但簡(jiǎn)化了反應(yīng)步驟，而且提高了得率。HPLC-MS結(jié)果顯示：合成的*與工業(yè)生產(chǎn)的*結(jié)構(gòu)*一致。乙酰異戊酰泰樂(lè)菌素（AIV）是另一種重要的泰樂(lè)菌素衍生物，它是通過(guò)耐熱鏈霉菌生物轉(zhuǎn)化泰樂(lè)菌素，在泰樂(lè)菌素的3’-羥基位置乙酰基化和4”-羥基位置異戊酰基化而得。通過(guò)優(yōu)化，本研究建立了優(yōu)化的耐熱鏈霉菌—大腸桿菌接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，整合表達(dá)了血紅蛋白基因（vhb），搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示血紅蛋白基因的表達(dá)對(duì)耐熱鏈霉菌轉(zhuǎn)化泰樂(lè)菌素幾乎沒(méi)有影響。通過(guò)PCR-targeting和在弗氏鏈霉菌中應(yīng)用的快速基因中斷法對(duì)負(fù)責(zé)相應(yīng)酰基化功能的acyB1-B2基因進(jìn)行了功能研究，先后得到acyB1-B2基因中斷菌株、acyB1基因中斷菌株，并對(duì)相應(yīng)中斷菌株進(jìn)行了互補(bǔ)，得到相應(yīng)的基因互補(bǔ)菌株。

                      研究表明：acyB1基因的中斷對(duì)acyA基因功能沒(méi)有影響，而以前報(bào)道的acyB1的正調(diào)控基因acyB2的中斷會(huì)導(dǎo)致了acyA基因表達(dá)水平的下降95％以上。研究表明acyB2基因應(yīng)該是碳霉素生物合成基因簇中的一個(gè)全局性正調(diào)控因子，它不僅負(fù)責(zé)對(duì)acyB1基因的正調(diào)控作用，而且還至少負(fù)責(zé)對(duì)acyA基因和紅霉糖糖基轉(zhuǎn)移酶基因的正調(diào)控。在耐熱鏈霉菌中存在兩個(gè)抗性基因，分別為carA和carB，其中carA類似泰樂(lè)菌素的tlrC，為ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；CarB為核糖體單甲基化酶，類似泰樂(lè)菌素的tlrB。為提高AIV生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中菌體對(duì)泰樂(lè)菌素的抗性，通過(guò)整合表達(dá)*抗性基因（ermE），抗性平板結(jié)果顯示耐熱鏈霉菌對(duì)泰樂(lè)菌素的抗性提高四倍以上，而相應(yīng)的酰基化功能沒(méi)有變化，這對(duì)解決工業(yè)生產(chǎn)上底物投料濃度問(wèn)題有一定的幫助。本研究還對(duì)在鏈霉菌中普遍存在的負(fù)調(diào)控基因nsdA（negative regulator of Streptomyces differentiation）進(jìn)行了研究。通過(guò)PCR-targeting的方法對(duì)耐熱鏈霉菌的nsdA基因進(jìn)行了中斷，得到相應(yīng)的突變株。

                       搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示：耐熱鏈霉菌nsdA基因的中斷可以提高其酰基化酶的酶活，與出發(fā)菌株相比，在搖瓶水平，在相同投料濃度下，nsdA中斷株AIV的轉(zhuǎn)化率從82％提高到93％。本研究還對(duì)耐熱鏈霉菌的底物耐受性進(jìn)行了探索，得到了乙酰脫紅霉糖泰樂(lè)菌素和一種新的*衍生物