問(wèn)題1：培養(yǎng)液pH值變化太快

可能原因

(1)CO2張力不對(duì)

(2)培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊

(3)NaHCO3緩沖系統(tǒng)緩沖力不足

(4)培養(yǎng)液中鹽濃度不正確

(5)細(xì)菌、酵母或真菌污染

建議解決方法

(1)按培養(yǎng)液中NaHCO3濃度增加或減少培養(yǎng)箱內(nèi)CO2濃度，2.0g/L到3.7g/L濃度NaHCO3對(duì)應(yīng)CO2濃度為5%到10%。

(2)松開(kāi)瓶蓋1/4圈。

(3)改用不依賴CO2培養(yǎng)液。加HEPES緩沖液至10到25mM終濃度。

(4)在CO2培養(yǎng)環(huán)境中改用基于Earle′s鹽配制的培養(yǎng)液，在大氣培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)改用Hanks鹽配制的培養(yǎng)液。

(5)丟棄培養(yǎng)物，或用抗生素除菌。

問(wèn)題2：培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀，但pH值不變

可能原因

(1)洗滌劑清洗后殘留有磷酸鹽，將培養(yǎng)基成分沉淀下來(lái)

(2)冰凍保存培養(yǎng)液

建議解決方法

(1)用去離子水反復(fù)沖洗玻璃器皿，然后滅菌。

(2)將培養(yǎng)液加熱到37℃，搖動(dòng)使其溶解如沉淀仍然存在，丟棄培養(yǎng)液。

問(wèn)題3：培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀，同時(shí)pH發(fā)生變化

可能原因

細(xì)菌或真菌污染

建議解決方法

丟棄培養(yǎng)物，或用抗生素除菌。

問(wèn)題4：培養(yǎng)細(xì)胞不貼壁

可能原因

(1)*消化過(guò)度

(2)支原體污染

(3)培養(yǎng)瓶瓶底不干凈

(4)培養(yǎng)液pH值過(guò)堿(NaHCO3分解)

(5)消化液或培養(yǎng)液配制錯(cuò)誤、過(guò)期儲(chǔ)存、儲(chǔ)存不當(dāng)

(6)細(xì)胞老化(如傳代前細(xì)胞已匯合導(dǎo)致失去貼附性)

(7)接種細(xì)胞起始濃度太低或太高

建議解決方法

(1)縮短*消化時(shí)間或降低*濃度。

(2)分離培養(yǎng)物，檢測(cè)支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。

(3)注意刷洗，或換用一次性塑料培養(yǎng)瓶

(4)使用無(wú)菌醋酸溶液調(diào)整pH值或充入無(wú)菌CO2(將培養(yǎng)液敞口放入培養(yǎng)箱也可)

(5)重新配置消化液或培養(yǎng)液

(6)啟用新的保種細(xì)胞

(7)調(diào)節(jié)*接種細(xì)胞濃度

問(wèn)題5：懸浮細(xì)胞成簇

可能原因

(1)培養(yǎng)液中含鈣、鎂離子

(2)支原體污染

(3)蛋白酶過(guò)度消化使得細(xì)胞裂解釋

(4)DNA污染

建議解決方法

(1)用無(wú)鈣鎂*洗滌細(xì)胞，輕輕吹吸細(xì)胞獲得單細(xì)胞懸液。

(2)分離培養(yǎng)物，檢測(cè)支原體。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。

(3)用DNase I處理細(xì)胞。

問(wèn)題6：原代細(xì)胞培養(yǎng)物污染

可能原因

原代培養(yǎng)組織在進(jìn)入培養(yǎng)前已污染

建議解決方法

培養(yǎng)前用含高濃度抗生素的*反復(fù)沖洗組織。

問(wèn)題7：培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)減慢

可能原因

(1)由于更換不同培養(yǎng)液或血清

(2)培養(yǎng)液中一些細(xì)胞生長(zhǎng)必需成分如*或生長(zhǎng)因子耗盡或缺乏或已被破壞。

(3)培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染

(4)試劑保存不當(dāng)

(5)接種細(xì)胞起始濃度太低

(6)細(xì)胞已老化

(7)支原體污染

建議解決方法

(1)比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)。讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液。

(2)換入新鮮配制培養(yǎng)液，或補(bǔ)加*及生長(zhǎng)因子。

(3)用無(wú)抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄培養(yǎng)物。或用抗生素除菌。

(4)血清需保存在-5℃到-20℃。培養(yǎng)液需在2-8℃避光保存。含血清*培養(yǎng)液在2-8℃保存，并在2周內(nèi)用完。

(5)增加接種細(xì)胞起始濃度。

(6)換用新的保種細(xì)胞。

(7)分離培養(yǎng)物，檢測(cè)支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。

問(wèn)題8：培養(yǎng)細(xì)胞死亡

可能原因

(1)培養(yǎng)箱內(nèi)無(wú)CO2

(2)培養(yǎng)箱內(nèi)溫度波動(dòng)太大

(3)細(xì)胞凍存或復(fù)蘇過(guò)程中損傷

(4)培養(yǎng)液滲透壓不正確

(5)培養(yǎng)液種有毒代謝產(chǎn)物堆積

(6)更多原因參考問(wèn)題4和問(wèn)題7

建議解決方法

(1)檢測(cè)培養(yǎng)箱內(nèi)CO2

(2)檢查培養(yǎng)箱內(nèi)溫度

(3)取新的保存細(xì)胞種

(4)檢測(cè)培養(yǎng)液滲透壓。注意：大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞能耐受滲透壓為260– 350 mOsm/kg。加入額外試劑如HEPES或藥物都有可能影響培養(yǎng)液滲透壓。

(5)換入新鮮培養(yǎng)液

(6)更多解決方法參考問(wèn)題4和問(wèn)題7