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1．酶標直接法和間接法
Nakane（1966）將辣根過氧化物酶（HRP） 標記在抗體免疫球蛋白分子上，創建了酶標記免疫組化的直接法、間接法和橋法。
2．PAP法
Stemberger（1969）在酶橋法的基礎上，建立了非標記抗體法，先將HRP免疫兔、羊或鼠，制成抗HRP抗體，再與HRP結合，制備成PAP復合物，其敏感性要比酶標直接法、間接法高出許多倍，其背景染色也要優于直接法和間接法。在此基礎上又出現了許多PAP法變型方法，如雙PAP法、ASPAPAP法、APAAP法等。
3．ABC法
20世紀60年代初，人們發現*（biotin）與親和素（卵白素，avidin）之間具有高度的親和性，是自然界中具有zui強親和力的物質之一。到了20世紀70年代，人們又發現*可以和抗體交聯，且*或親和素與過氧化物酶或熒光素結合后，并不影響它們的生物學活性。Guesdon等（1979）提出了標記*、親和素以及*—親和素搭橋法。在此基礎上，許世明（1981）建立于標記親和素、*間接橋法和ABC法。此方法已沿用了幾十年，得到普遍認可，物美價廉，背景干凈，但是缺點是操作比較麻煩，靈敏度沒有目前一些新的檢測系統高。SP法（或稱LSAB法）在ABC法基礎上作了許多改進，將鏈霉親和素直接偶合在一起，減少了操作步驟，增加了靈敏度?，Fzui大的問題是內源性*的干擾，造成非特異性背景染色，從而直接影響到對染色結果的判斷。尤其在人體肝、腎、腸等組織中存在豐富的內源性*，加上目前常規應用的抗原修復方法可以激活內源性*，非特異性背景染色在某些組織的免疫組化染色中已變得尤為突出。為了克服這一缺陷，人們想出了許多種克服的方法，例如在抗原修復后用親和素或用20％雞蛋清進行封閉，但是效果往往不夠理想。另一種克服方法是采用由Zymed公司推出的NBA（非*檢測系統）。該系統用FITC代替*與二抗結合，三抗是結合了HRP的抗FIT抗體，而不用鏈霉親和素—HRP復合物。由于在人體組織中到目前為止尚未發現有內源性的能與FITC結合的物質，從而避免了因非特異性結合而產生的非特異性假陽性背景染色。
雖然NBA系統成功地克服于非特異背景染色，而且具有與*—親和素檢測系統相同的敏感性，但是卻沒有使檢測步驟有任何簡化。在實際工作中，為了適應臨床病理越來越多的日常工作需求，人們渴求一種更加簡便易行的方法，先后有多家公司推出二步法敏感的免疫組化檢測系統試劑，例如EnVision試劑、PicTureTM—plus和SuperPictureTM—plus試劑、UIP試劑和PowerVisionTM試劑。
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