細(xì)胞因子在機(jī)體免疫應(yīng)答過程中起著十分重要的作用。在某些疾病時(shí)，體內(nèi)細(xì)胞因子及其受體表達(dá)可發(fā)生異常，與機(jī)體免疫功能低下或發(fā)生病理損傷有關(guān)。因此，在臨床免疫學(xué)中越來越重視對(duì)細(xì)胞因子及其受體的檢測(cè)。在基礎(chǔ)免疫研究中，常需檢測(cè)不同條件培養(yǎng)液中細(xì)胞因子的活性，并探討細(xì)胞因子產(chǎn)生水平與免疫細(xì)胞表型、增殖、殺傷及其它功能的關(guān)系。此外，原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中表達(dá)的重組細(xì)胞因子或經(jīng)過不同工藝純化后的產(chǎn)品需測(cè)定其活性和含量。

從細(xì)胞因子及其受體檢測(cè)的水平來說，可以分為基因組DNA、mRNA和蛋白三個(gè)不同的水平，后者又包括胞漿內(nèi)、膜表面以及分泌到體液或培養(yǎng)上清等三種不同形式細(xì)胞因子。目前應(yīng)用zui多的是檢測(cè)體液或培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子以及膜表面的細(xì)胞因子受體。

一、生物學(xué)活性檢測(cè)法

細(xì)胞因子生物學(xué)活性檢測(cè)法是根據(jù)某些細(xì)胞因子特定的生物學(xué)活性，應(yīng)用相應(yīng)的指示系統(tǒng)和標(biāo)準(zhǔn)品來反映待測(cè)標(biāo)本中某種細(xì)胞因子的活性水平，一般以活性單位來表示。生物學(xué)檢測(cè)法一般敏感性較高，直接表示待測(cè)標(biāo)本中的活性水平。但實(shí)驗(yàn)周期較長，如集落形成法需10～14天；易受細(xì)胞培養(yǎng)中某些因素的影響，如血清、pH、藥物；易受生物學(xué)活性相同或相近的其它細(xì)胞因子的影響，如檢測(cè)IL-2時(shí)可受IL-4的干擾，TNF-α和TNF-β（淋巴毒素）表現(xiàn)出極為相似的生物學(xué)作用；易受待檢樣品中某些細(xì)胞因子抑制物的干擾，如IL-1的活性可被IL-1受體拮抗物（IL-1ra）所抑制，TNF-α可被TNF-BP所阻斷；不能區(qū)分某些細(xì)胞因子的型和亞型，如IFN-α、β和γ，以及IFN-α中不同的亞型顯示相同的生物學(xué)活性；某些指示細(xì)胞長期培養(yǎng)易發(fā)生突變；不同指示細(xì)胞對(duì)同一種細(xì)胞因子的敏感性不同，所獲結(jié)果難于標(biāo)準(zhǔn)化；此外，某些人源的細(xì)胞因子如hIL-2對(duì)小鼠細(xì)胞起作用，但鼠源性的IL-2對(duì)人的細(xì)胞則無刺激作用。

生物學(xué)檢測(cè)的方法大致可分為增殖或增殖抑制、集落形成、直接殺傷靶細(xì)胞、保護(hù)靶細(xì)胞免受病毒攻擊、趨化作用以及抗體形成法等幾類。

（一）增殖或增殖抑制法

其基本原理是應(yīng)用某一細(xì)胞因子能特異地刺激或抑制某些指示細(xì)胞的增殖，通過³H-TdR摻入或MTT法顯色，反映待檢細(xì)胞因子的活性水平。

（二）集落形成法

其基本原理是應(yīng)用骨髓干細(xì)胞體外半固體培養(yǎng)系統(tǒng)，根據(jù)不同造血因子能誘導(dǎo)干細(xì)胞或定向造血祖細(xì)胞形成某一種或某些種類細(xì)胞的集落，通過對(duì)形成集落形態(tài)學(xué)、酶學(xué)鑒定，計(jì)算不同種類集落形成的數(shù)量和比例，反映待測(cè)標(biāo)本中CSF的種類和活性水平。

（三）直接殺傷靶細(xì)胞

在細(xì)胞因子中TNF-α、TNF-β具有直接殺傷某些腫瘤細(xì)胞的作用，采用TNF敏感的細(xì)胞株如小鼠成纖維細(xì)胞株L929，以及WEHI164亞克隆13作為指示細(xì)胞，通過³H-TdR釋放法或染料染色法等可檢測(cè)待檢樣品中TNF的活性水平。

（四）保護(hù)靶細(xì)胞免受病毒的攻擊

靶細(xì)胞受某些病毒感染后可發(fā)生明顯病變和死亡，干擾素可保護(hù)靶細(xì)胞免受病毒的攻擊，常用的病毒是水皰性口炎病毒（vesicular stomatitis virus, VSV），敏感的指示細(xì)胞為喉癌的上皮細(xì)胞株Hep2和羊膜的上皮細(xì)胞WISH，通過干擾素（IFN-α、IFN-β、IFN-γ）抑制病毒致病變的程度，計(jì)算出待測(cè)樣品中IFN的活性單位。

（五）趨化作用

IL-8對(duì)多形核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞具有趨化作用，可用小室法或軟瓊脂趨化法，PMN或淋巴細(xì)胞作為指示細(xì)胞，以細(xì)胞趨化的程度來反映樣品中IL-8活性水平。

（六）抗體形成法

IL-6可在體外刺激某些B淋巴細(xì)胞系產(chǎn)生和分泌免疫球蛋白，常用的指示細(xì)胞有分泌IgG的ARH-77、CESS和分泌IgM的SKW6.CL-4。在一定的條件下，待檢樣品中IL-6的水平與培養(yǎng)細(xì)胞上清IgG或IgM水平正相關(guān)，通過標(biāo)準(zhǔn)IL-6的對(duì)照可推算出待檢樣品中IL-6的活性。

表4-22 細(xì)胞因子生物學(xué)活性檢測(cè)方法（舉例）  

二、免疫學(xué)檢測(cè)法

免疫學(xué)檢測(cè)法的基本原理是細(xì)胞因子（或受體）與相應(yīng)的特異性抗體（單克隆抗體或多克隆抗體）結(jié)合，通過同位素、熒光或酶等標(biāo)記技術(shù)加以放大和顯示，從而定性或定量顯示細(xì)胞因子（或受體）的水平。這類方法的優(yōu)點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)周期短，少受抑制物或相似生物學(xué)功能因子的干擾，如抗體的特異性高可區(qū)分不同型或亞型的細(xì)胞因子（如IFN），一次能檢測(cè)大量標(biāo)本，易標(biāo)準(zhǔn)化。與生物學(xué)活性檢測(cè)方法相比，免疫學(xué)檢測(cè)法在許多情況下敏感性低于前者，所得結(jié)果不表示生物學(xué)活性，有的McAb只能識(shí)別重組的細(xì)胞因子，在檢測(cè)天然的細(xì)胞因子中受到限制。

免疫學(xué)檢測(cè)的方法多采用ELISA和RIA法，可以分為夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法和間接法。

（一） ELISA（或RIA）夾心法

根據(jù)抗體性質(zhì)和特異性不同可有以下幾種不同的夾心法ELISA。

1. PcAb與McAb夾心法用純化的多克隆抗體（PcAb）包被板子，加待檢細(xì)胞因子（或可溶性受體）和標(biāo)準(zhǔn)品，上層加酶標(biāo)記的McAb。有時(shí)為了增加敏感性，上層加McAb后再用酶標(biāo)記第二抗體顯色。

2. McAb與PcAb夾心法用McAb包被板子，加待檢樣品，上層加酶標(biāo)記的PcAb。有時(shí)為了增加敏感性，上層加PcAb后再用針對(duì)PcAb的酶標(biāo)記抗抗體。

3.雙McAb夾心法選擇和應(yīng)用識(shí)別同一個(gè)細(xì)胞因子（或受體）分子上不同表位的兩種McAb，其中一種包被板子，另一種McAb標(biāo)記酶。由于單克隆抗體親和力識(shí)別表位均一，從質(zhì)量控制角度來看，一般比上兩種夾心法易控制。如目前已商品化檢測(cè)細(xì)胞因子（或其受體）的檢測(cè)盒大多采用雙單克隆抗體夾心法。

4.細(xì)胞、McAb夾心法用表達(dá)IL-2R的MT-1細(xì)胞包被板子，加入待檢IL-2或標(biāo)準(zhǔn)品，上層加¹²⁵I標(biāo)記的McAb，根據(jù)γ計(jì)數(shù)cpm值推算出待檢IL-2含量。

（二）競(jìng)爭(zhēng)法

有報(bào)道用競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)IL-2的水平。用兔抗IL-2 PcAb包被板子，同時(shí)加入¹²⁵I標(biāo)記的IL-2和待測(cè)IL-2，根據(jù)γ計(jì)數(shù)cpm值得知待檢IL-2對(duì)¹²⁵I-IL-2與PcAb競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的程度，從而推算出待測(cè)標(biāo)本IL-2的含量。這種方法檢測(cè)IL-2的敏感性可達(dá)50pg/ml。

為了增加敏感性，在上述系統(tǒng)中可再連接上*，再用鏈霉親和素（streptavidin）酶標(biāo)記物進(jìn)行放大。此外，還可用化學(xué)發(fā)光、改進(jìn)顯色底物等措施提高檢測(cè)方法的敏感性。