摘要 要在一種宿主表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)外源蛋白并獲得較高產(chǎn)量，必須要較為全面地了解影響其表達(dá)的諸多因素。影響外源基因在巴氏畢赤酵母中表達(dá)的因素主要包括：外源基因的特性、表達(dá)框的染色體整合位點(diǎn)和方式、宿主菌的甲醇利用表型、基因劑量、分泌信號(hào)、產(chǎn)物穩(wěn)定性和翻譯后修飾等。本文就這些因素進(jìn)行分析，并提出一定的對(duì)策和建議。

酵母菌是單細(xì)胞真核生物，具有生長快、易于遺傳操作、能對(duì)外源蛋白進(jìn)行翻譯后加工和修飾、不產(chǎn)生有毒產(chǎn)物等特點(diǎn)，被認(rèn)為是表達(dá)外源蛋白的合適宿主。幾種工業(yè)酵母尤其是巴氏畢赤酵母（pichia pastoris, Pp），因具有旺盛的生長力以及其它一些*的性質(zhì)，已發(fā)展成為較成熟的蛋白生產(chǎn)的表達(dá)系統(tǒng)。已有許多細(xì)菌、真菌和高等動(dòng)植物的基因在Pp中成功表達(dá)（如破傷風(fēng)毒素片段Ｃ，12g/L），但也有許多蛋白的表達(dá)量并不理想（如多瘤病毒大T抗原，0.5mg/L），甚至不能表達(dá)（如HIV表面糖蛋白）。另外，酵母表達(dá)系統(tǒng)的局限性還在于分泌產(chǎn)物的不均一性，包括聚合體的存在、信號(hào)肽加工不*以及內(nèi)部降解等現(xiàn)象。所有這些都提醒我們?cè)赑p中表達(dá)外源蛋白時(shí)，應(yīng)周密考慮影響其表達(dá)的各個(gè)因素。

1、外源基因特性
外源基因在Pp中表達(dá)時(shí)，其自身就是影響表達(dá)水平的重要因素。不同的培養(yǎng)基配方、發(fā)酵參數(shù)和飼養(yǎng)方案主要是通過提高細(xì)胞總數(shù)而并非單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)率來提高外源蛋白的產(chǎn)量。Fahnestock等發(fā)現(xiàn)隨著外源的蛛牽拉絲蛋白基因拷貝數(shù)的增加，其生產(chǎn)效率會(huì)相對(duì)有所降低。另外，許多高A+T含量的基因常會(huì)由于提前終止而不能有效轉(zhuǎn)錄引;不合適的mRNA5\\'非翻譯區(qū)的核苛酸序列和長度也可能會(huì)便基因的表達(dá)不盡如人意。提前終止被認(rèn)為是一種具有種屬特異性的現(xiàn)象，譬如在Pp中不能表達(dá)的HIV ENV蛋白在啤酒酵母中卻表達(dá)良好。因此，可以通過調(diào)整高A+T含量區(qū)的核甘酸組成來避免提前終止的發(fā)生。而Sreekrishna等通過調(diào)整人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）的mRNA5\\'非翻譯區(qū)與醇氧化酶（alcohol oxidase 1，AOX1）的5\\'非翻譯區(qū)相同后，HSA的表達(dá)量可以提高50倍以上。但遺憾的是，限于目前對(duì)Pp的了解程度，仍然無法預(yù)見某種外源蛋白是否能在其中獲得高產(chǎn)甚至僅僅能否表達(dá)。至僅僅能否表達(dá)。

2、表達(dá)框的染色體整合位點(diǎn)和方式
　　雖然相對(duì)于自主復(fù)制載體來講，整合性載體的轉(zhuǎn)化率較低，但由于Pp沒有天然質(zhì)粒，所以設(shè)計(jì)表達(dá)載體偏向于染色體整合，通過同源重組，載體整合到細(xì)胞染色體中間。整合性載體具有表達(dá)框穩(wěn)定和可控制整合位點(diǎn)等*性，并且能夠發(fā)生多位點(diǎn)整合而獲得多拷貝。
AOXl和*脫氫酶（histidinol dehydrogenase , HIS4）基因位點(diǎn)都已被成功用于表達(dá)外源蛋白。Sreekrishna等注意到his基因座的lacZ表達(dá)框偶有缺失。這種缺失源于表達(dá)框中his4染色體突變拷貝與完好的his4基因的基因轉(zhuǎn)換。因此，看起來aox1位點(diǎn)是較為理想的位點(diǎn)。

3、宿主菌的甲醇利用表型（Mut＋和MutＳ）
　　用末端與aox1基因5\\'和3\\'端同源的線性DNA轉(zhuǎn)化Pp HIS4菌株可導(dǎo)致Mx1結(jié)構(gòu)基因的特異性剔除。aox1基因缺失的酵母在甲醇限制性培養(yǎng)基上生長緩慢（methanol utilization slow , MutＳ或Mut-），它們只能利用弱的aox2基因啟動(dòng)合成aox2基因啟動(dòng)合成AOX；而aox1基因完整的酵母則生長正常（Mut＋）。原則上，如果是胞內(nèi)表達(dá)，應(yīng)盡量用Mut－細(xì)胞，這樣得到的蛋白產(chǎn)物中醇氧化酶蛋白量較少而目的蛋白量相對(duì)較多（約占Pp總分泌蛋白量的30-90%，如人乙酰*酯酶B變異鏈的含量占到90%，使下游純化更易進(jìn)行。當(dāng)誘導(dǎo)AOX1時(shí)，轉(zhuǎn)化子不能同時(shí)高水平產(chǎn)生酒精氧化酶和外源蛋白，與野生型Mut＋比較，Mut－細(xì)胞對(duì)氧的要求亦較低，生長也較慢。為解決這個(gè)問題，Jeffrey等用甲醇加甘油混合飼養(yǎng)，得到了255mg/L的CD40配體（CD40L）。但由于甘油可部分阻遏aoxl啟動(dòng)子，蛋白表達(dá)可能并不處于*水平。Sreekrishna等zui近運(yùn)用*和甲醇混合批量飼養(yǎng)發(fā)酵，在不到4個(gè)星期的時(shí)間里，他們用一個(gè)4L的發(fā)酵罐連續(xù)完成了幾個(gè)周期的生產(chǎn)。在這種發(fā)酵方式中，大部分碳源由*提供，減少了總的甲醇消耗，因而效率大大提高。
zui近，一種無需甲醇誘導(dǎo)而能組成性表達(dá)外源蛋白的畢赤酵母載體pCAPZ和pGAPZa已經(jīng)構(gòu)建成功，組成性表達(dá)的蛋白量與該蛋白對(duì)酵母菌的毒性有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)它們常能生產(chǎn)比誘導(dǎo)型載體pPICZ和pPICZa更高的外源蛋白。這些載體均利用了編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）基因的啟動(dòng)子。Doring等分別用pGAPZB和pPICZB來生產(chǎn)兔腎肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（rPEPT2）以及人小腸肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（hPEPT2）,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前者表達(dá)的此兩種蛋白的產(chǎn)量均比后者高4倍。看來在生產(chǎn)哺乳動(dòng)物膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白時(shí)，pGAP比pAOX1更理想。