NADP-蘋果酸脫氫酶（NADP-malate dehydrogenase, NADP-MDH）

試劑盒說明書

測定意義：

MDH （EC 1.1.1.37）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，線粒體中MDH是TCA循環的關鍵酶之一，催化蘋果酸形成草酰乙酸；相反，胞漿中MDH催化草酰乙酸形成蘋果酸。草酰乙酸是重要的中間產物， 連接多條重要的代謝途徑。因此，MDH在細胞多種生理活動中扮演著重要的角色，包括線粒體的能量代謝、 蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統、活性氧代謝和抗病性等。根據不同的輔酶特異性，MDH分為NAD-依賴的MDH和NADP-依賴的MDH， NADP-MDH主要存在于真核細胞中。

測定原理：

NADP-MDH催化NADPH還原草酰乙酸生成蘋果酸，導致340nm處光吸收下降。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、1 mL石英比色皿和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一、提取液60 mL×1瓶，在4℃保存；

試劑二、液體50 mL×1瓶，在4℃保存；

試劑三、粉劑×2支，-20℃保存；臨用前加入300μL雙蒸水，用不完的試劑仍-20℃保存；

試劑四、粉劑×2支，-20℃保存；臨用前加入300μL雙蒸水，用不完的試劑仍-20℃保存。

樣本測定的準備：

1、 細菌、細胞或組織樣品的制備 ： 

細菌或培養細胞：收集細菌或細胞到離心管內，棄上清，按照每200萬細菌或細胞加入400μL提取液，超聲波破碎細菌或細胞（功率20％，超聲3s，間隔10s，重復30次），8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一進行冰浴勻漿；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定操作表：

將上述試劑按順序加入1 mL石英比色皿中，混勻后在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種），340 nm波長下記錄初始吸光度A1和反應1min后的吸光度A2，計算ΔA=A1-A2。

注意事項：

1、粗酶液的提取必須在0℃ - 4℃中操做完成，以防止酶變性失活。

2、實驗時，試劑三、試劑四和樣本在冰上放置，以免變性和失活。試劑二37℃或25℃室溫放置。

NADP-MDH活力單位的計算：

1、血清（漿）NADP-MDH活力的計算

單位的定義：每升血清（漿）在反應體系中每分鐘消耗1 μmol的NADPH定義為一個酶活力單位。 

NADP-MDH（U/L）=反應總體積（800μL）÷樣本體積（20μL）÷反應時間(1min)÷NADPH消光系數（6.22×10-3）×ΔA= 6430 ×ΔA 

2、組織中NADP-MDH活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白在反應體系中每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。

NADP-MDH（U/mg prot）=反應總體積（800μL）÷樣本體積（20μL）÷反應時間(1min)÷NADPH消光系數（6.22×10-3）×ΔA÷蛋白濃度（mg/mL）= 6430 × ΔA ÷蛋白濃度（mg/mL）

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織在反應體系中每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。

NADP-MDH（U/g 鮮重）=反應總體積（800μL）÷樣本體積（20μL）÷反應時間(1min)÷NADPH消光系數（6.22×10-3）×ΔA÷樣本鮮重（g/mL）=6430 × ΔA ÷樣本鮮重（g/mL）

3細菌或培養細胞中NADP-MDH活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白在反應體系中每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。

NADP-MDH（U/mg prot）=反應總體積（800μL）÷樣本體積（20μL）÷反應時間(1min)÷NADPH消光系數（6.22×10-3）×ΔA÷蛋白濃度（mg/mL）= 6430 × ΔA ÷蛋白濃度（mg/mL）

（2）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞在反應體系中每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。

NADP-MDH（U/104 cell）=反應總體積（800μL）÷樣本體積（20μL）÷反應時間(1min)÷NADPH消光系數（6.22×10-3）×ΔA÷細菌或細胞密度（104/mL）=6430 × ΔA ÷細菌或細胞密度（104/mL）