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蛋白分離層析親和法蛋白質(zhì)純化介質(zhì) NiNTABead6FF2

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更新時間:2023-06-27 07:41:00瀏覽次數(shù):119次

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所在地區(qū):江蘇蘇州市

聯(lián)系人:耿少華 (經(jīng)理)

產(chǎn)品簡介

蛋白分離層析親和法蛋白質(zhì)純化介質(zhì) NiNTABead6FF是以高度交聯(lián)的6%瓊脂糖凝膠為基質(zhì),配體與NiNTABead相同。NiNTABead6FF除了可以耐受苛刻的試劑條件外,因其耐壓的基質(zhì),可以耐受高達0.3MPa的壓力,更穩(wěn)定,因此該產(chǎn)品更適合用于工業(yè)大規(guī)模蛋白的純化,可以在相對較高的流速下,實現(xiàn)對目的蛋白質(zhì)純化。

詳細介紹

Ni NTA Beads 6FF是以高度交聯(lián)的6%瓊脂糖凝膠為基質(zhì),配體與Ni NTA Beads相同。Ni NTA Beads 6FF除了可以耐受苛刻的試劑條件外,因其耐壓的基質(zhì),可以耐受高達0.3 MPa的壓力,更穩(wěn)定,因此該產(chǎn)品更適合用于工業(yè)大規(guī)模蛋白的純化,可以在相對較高的流速下,實現(xiàn)對目的蛋白的純化。


Ni-NTA-Beads-6FF

6FF性能

6FF性能2


2.純化流程

2.1 緩沖液的準備

可使用下列推薦緩沖液,也可根據(jù)自己的使用習慣配置不同的緩沖液體系,基本原理就是低咪唑上樣,高咪唑洗脫,或者高 pH上樣,低pH 洗脫。緩沖液在使用前用0.22 um 或者0.45 um 濾膜過濾。因為 Ni NTA Beads 6FF 可以用于可溶蛋白和包涵體蛋白的純化,兩種方法所需緩沖液不同。具體配置方法見表3、表4和表5。

6FF配方

6FF配方2


2.2 樣品準備

2.2.1 細菌或酵母表達的蛋白

1)挑取單菌落到培養(yǎng)基中,根據(jù)載體使用說明,加入相應(yīng)濃度的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)相應(yīng)的時間。

2)表達結(jié)束后,將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到離心杯中,7,000 rpm(7,500×g),離心 15min 收集菌體,然后按照菌體∶Lysis Buffer=1∶10(W/V)加入Lysis Buffer,加入終濃度為1mM的 PMSF。加入(工作濃度為0.2-0.4 mg/ml,如果表達的宿主細胞內(nèi)含pLysS 或 pLysE,可以不加),(同時也可加入其他蛋白酶抑制劑,但不能影響目的蛋白與樹脂的結(jié)合)。

3)將菌體沉淀懸浮起來,(如果菌液濃度高,也可考慮加入10 ug/ml RNase A和5 ug/ml DNase I),混勻,放置于冰上,然后冰上超聲

破碎細胞,至菌液基本保持澄清。

4)將澄清的破碎液轉(zhuǎn)移至離心管中,10.000 rpm(15.000×g),4℃離心20-30 min。取上清,置于冰上備用或-20℃C保存。

2.2.2 酵母、昆蟲和哺乳細胞分泌表達可溶性蛋白

1)將細胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心杯,5,000 rpm(3,800×g),離心10 min,收集菌體得上清,如上清中不含 EDTA、和還原劑等物質(zhì),即可直接加入柱子使用;如含有 EDTA、和還原劑等物質(zhì),需用Lysis Buffer 透析才能加入柱子。

2)對于大量體積的上清,需加入硫酸銨沉淀濃縮后,蛋白還需用Lysis Buffer 透析后才能加入柱子。

2.2.3 包涵體蛋白純化(變性條件)

1)將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到離心杯中,7,000 rpm(7,500×g),離心 15min 收集菌體,去掉上清。

2)按照菌體∶Lysis buffer(不含 8M 尿素)=1∶10(W/V)將菌體懸浮起來混勻,冰浴超聲破碎。

3)將破碎液轉(zhuǎn)移至離心管中,10,000 rpm(15.000×g),4°C離心20-30 min。去掉上清,步驟2和3可以重復(fù)一次。

4)按照菌體∶Lysis buffer(含8M 尿素)=1∶10(W/V)將包涵體懸浮起來。

5)變性條件下進行His 標簽蛋白純化,具體緩沖液配方見表4、表 5。

2.3 Ni NTA Beads 6FF的裝填

2.3.1重力柱的裝填

1)取合適規(guī)格的重力層析柱,裝入下墊片,加入適量純水潤洗柱管和墊片,關(guān)閉下出口。

2)將 Ni NTA Beads 6FF 混合均勻,用槍頭吸取適量漿液加入至重力柱中(介質(zhì)實際體積占懸液的一半),打開下出口流干保護液。

3)加入適量純水沖洗介質(zhì),待柱管中液體重力流干后,關(guān)閉下出口。

4)裝入潤洗后的上墊片,確保墊片與填料之前沒有空隙,且保持水平。

5)裝填好的重力柱可以直接加入平衡液進行平衡,暫不使用時則加入保護液,4-30℃保存。

2.3.2 中壓層析柱的裝填

Ni NTA Beads 6FF被廣泛應(yīng)用于工業(yè)純化,因此,涉及到各種中壓色譜層析柱的填裝,下面介紹 Ni NTABeads6EF填裝層析柱的方法。裝柱前根據(jù)層析柱直徑計算柱子底面積,根據(jù)所需裝柱高度計算所需介質(zhì)體積,公式如下;  V=1.15022h



  • V∶所需介質(zhì)體積 ml
  • 1.15∶壓縮系數(shù)
  • r∶柱管半徑 cm 
  • h∶裝填高度 cm


注意∶所取懸液體積應(yīng)為介質(zhì)體積的兩倍,因為介質(zhì)體積只占懸液總體積的一半,另一半為保護液。

1)用去離子水沖洗層析柱底篩板與接頭,確保柱底篩板上無氣泡,關(guān)閉柱底出口,并在柱底部留出1-2 cm 的去離子水。

2)將介質(zhì)懸浮起來,小心的將漿液連續(xù)地倒入層析柱中。用玻璃棒沿著柱壁倒入漿液可減少氣泡的產(chǎn)生。


3)如果使用儲液器,應(yīng)立即在層析柱和儲液器中加滿水,將進樣分配器放置于漿液表面,連接至泵上,避免在分配器或進樣管中產(chǎn)生氣泡。4)打開層析柱底部出口,開啟泵,使其在設(shè)定的流速下進行。最初應(yīng)讓緩沖液緩慢流過層析柱,然后緩慢增加至最終流速,這樣可避免液壓對所形成柱床的沖擊,也可以避免柱床形成的不均勻。如果達不到推薦的壓力或流速,可以用你所使用泵的流速,這樣也可以得到一個很好的裝填效果。(注意∶在隨后的色譜程序中,不要超過裝柱流速的75%)當柱床高度穩(wěn)定后,在最后的裝柱流速下至少再上3倍柱床體積的去離子水。標上柱床高度。5)關(guān)閉泵,關(guān)閉層析柱出口。

6)如果使用儲液器,去除儲液器,將分配器置于層析柱中。

7)將分配器推向柱子至標記的柱床高度處。允許裝柱液進入分配器,鎖緊分配器接頭。8)將裝填好的層析柱連接至泵或色譜系統(tǒng)中,開始平衡。如果需要可以重新調(diào)整分配器。

2.4 樣品純化流程2.4.1 孵育法純化

1)根據(jù)純化的樣品量,取適量 Ni NTA Beads 6FF 加入離心管中,1000 rpm 離心 1min,吸棄上清;也可加入重力柱中,流干保護液。2)向離心管中加入5倍介質(zhì)體積的Lysis Buffer 清洗介質(zhì),1000 rpm離心1min,吸棄上清;如使用重力柱,則直接在重力柱中清洗,直接重力流干 Lysis Buffer;重復(fù)兩次以上。

3)加入樣品,封閉離心管或重力柱管,4℃振蕩孵育2-4 h或者37℃孵育 30 min-2 h。

4)孵育結(jié)束后,1000 rpm 離心1min,吸棄上清,或過濾收集介質(zhì),上清保留作為流穿,用于電泳鑒定。

5)用5倍介質(zhì)體積的Wash Buffer清洗介質(zhì),1000 rpm離心1 min 或重力柱管過濾,去除上清(注意不要吸到介質(zhì)),重復(fù)3-5次,中間建議更換新離心管。必要時可以調(diào)整咪唑的濃度進行洗雜。

6)加入3-5倍柱體積的Elution Buffer 進行洗脫,室溫孵育 10-15min,1000 rpm離心1 min 或重力柱管收集洗脫液,可重復(fù) 2-3次。

2.4.2 重力柱法純化

1)將裝填好的 Ni NTA Beads 6FF 重力柱用5倍柱體積 Lysis Buffer進行平衡,使填料處于與目的蛋白相同的緩沖液體系下,重復(fù) 2-3次。2)將樣品加到平衡好的重力柱中,樣品保留時間至少2 min,保證樣品和介質(zhì)充分接觸,收集流出液,可以反復(fù)上樣增加結(jié)合效率。

3)用 10-15倍柱體積的 Wash Buffer 進行洗雜,去除非特異性吸附的雜蛋白,收集洗雜液。必要時可以調(diào)整咪唑的濃度進行洗雜。

4)使用5-10倍柱體積的 Elution Buffer洗脫,分段收集,每一個柱體積收集一管,分別檢測,既可以保證所有結(jié)合的目的蛋白被洗脫,又可以得到高純度和高濃度的蛋白。


2.4.3 中壓層析柱法純化

Ni NTA Beads 6FF裝填好后,可以用各種常規(guī)的中低壓色譜系統(tǒng)。

1)將泵管道中注滿去離子水。去掉上塞子,將層析柱連接至色譜系統(tǒng)中,打開下出口,將預(yù)裝柱接到色譜系統(tǒng)中,并旋緊。

2)用 3-5倍柱體積的去離子水沖洗出儲存緩沖液。

3)使用至少5倍柱床體積的 Lysis Buffer 平衡色譜柱。

4)利用泵或樣品環(huán)上樣。注;樣品的粘度增加使得即使上樣體積很少,也會導(dǎo)致層析柱很大的反壓。上樣量不要超過柱子的結(jié)合能力。大量的樣品體積也可能造成很大的反壓,使得進樣器更難使用。

5)用Wash Buffer 沖洗柱子,直到紫外吸收達到一個穩(wěn)定的基線(一般至少10-15個柱體積)。

注∶在樣品和結(jié)合緩沖液中加入咪唑可以提高樣品純度。

6)用Elution Buffer采用一步法或線性梯度洗脫。

一步洗脫中,通常5倍柱體積洗脫液就足夠了。梯度洗脫可以用一個小的梯度,例如20 倍柱體積或更多,來分離不同結(jié)合強度的蛋白質(zhì)。

上述步驟介質(zhì)洗脫結(jié)束后,先用 Lysis Buffer 沖洗3倍柱體積,然后用純水沖洗5倍柱體積,再用20%乙醇沖洗2個柱體積,然后將介質(zhì)置于2-8℃保存。

2.5 SDS-PAGE 檢測

將使用純化產(chǎn)品得到的樣品(包括流出組分、洗雜組分和洗脫組分)以及原始樣品使用 SDS-PAGE檢測純化效果。


3.在位清洗

當填料使用過程中發(fā)現(xiàn)反壓過高或者填料上面出現(xiàn)明顯的污染時,需要進行在位清洗操作(Cleaning-in-Place,CIP)。建議按照下面操作去除填料上殘留的污染物,如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。去除強疏水結(jié)合的蛋白,脂蛋白和脂類

通過使用 30%異丙醇清洗 5-10個柱體積,接觸時間為 15-20 min 可以去除此類污染物。然后,再使用 10倍柱體積的去離子水清洗。也可

以選擇使用含有去污劑的酸性或堿性溶液,清洗填料2倍柱體積。例如,含有0.1-0.5% 非離子去污劑的0.1M 醋酸溶液,接觸時間為 1-2 h。去污劑處理后,需要使用70%的乙醇清洗5個柱體積,以去除去污劑。最后使用10倍柱體積的去離子水清洗。去除離子作用結(jié)合的蛋白

使用1.5M NaCI溶液清洗 10-15 min。然后,再使用去離子水清洗 10個柱體積。

4.填料再生

標簽蛋白親和純化填料所帶的鎳離子不需要經(jīng)常螯合去除和重新掛鎳離子。當填料使用過程中發(fā)現(xiàn)顏色變淺,或者填料載量明顯變低時,需要進行對填料進行鎳離子剝離和重新掛鎳離子,也就是填料再生。將填料裝填在合適的層析柱內(nèi),按照下面操作流程進行鎳離子剝離和重新掛鎳離子。

1)使用5倍柱體積去離子水清洗填料;

2)使用5倍柱體積 100 mM EDTA (pH 8.0)剝落鎳離子;3)使用 10倍柱體積去離子水清洗填料;

4)使用0.5M NaOH清洗5倍柱體積,停留 10-15min;5)使用去離子水清洗填料,直至 pH中性;6)使用3-5倍柱體積 100 mM NiSO4再生掛鎳;7)使用10倍柱體積去離子水清洗;

填料再生后,可以立即使用,如不立即使用,需要將填料懸浮于等體積的 20%乙醇中,置于4-30°℃ 保存。

6FF問題


6FF訂購信息


6FF訂購信息2


      蘇州阿爾法生物提供的瓊脂糖凝膠介質(zhì)、葡聚糖凝膠介質(zhì)等蛋白純化和分離填料以及相關(guān)生物試劑。另外還提供、氨酸標簽蛋白親和純化介質(zhì)、GST-tag蛋白親和純化介質(zhì)、 MBP-tag蛋白親和純化介質(zhì)、Biotin-tag蛋白親和純化介質(zhì)、Strep-tagll標簽親和純化介質(zhì)、 標簽抗體親和純化介質(zhì)等標簽蛋白親和層析介質(zhì); 離子交換層析  、色譜柱、離子交換層析樹脂、疏水層析介質(zhì)、 磁性微球等。

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