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天根miRcute多糖多酚植物miRNA提取分離試劑盒 DP504可從植物組織，特別是富含多糖多酚或淀粉的植物組織（如棉花葉片，馬鈴薯塊莖，蘋果，桃樹葉片等）中快速提取包含miRNA的總RNA，可同時處理大量不同樣品。提取的總RNA純度高，沒有蛋白和其它雜質的污染。
天根miRcute多糖多酚植物miRNA提取分離試劑盒 DP504
產品簡介
操作步驟：
使用前在漂洗液RWA和去蛋白液MRD中加入C?H?O，加入量請參見瓶上標 簽。
一、miRNA富集部分的提取 對miRNA的純度要求較高時，比如miRNA芯片研究、miRNA克隆建議采用此方法。
1．勻漿處理 50 mg植物葉片或果實果肉在液氮中迅速研磨成粉末，轉入到1.5 ml離心管中，加入500 μl裂解液SLM，顛倒混勻以保證裂解液浸沒所 有樣本，再加入1/10裂解液體積的助沉劑PLA，立即渦旋震蕩混勻。
注意 1：對于預期RNA得率小于10 μg的植物樣本，請使用100 mg的起始樣本量；對于富 含淀粉的樣本或成熟葉片，請將裂解液SLM用量增加至700 μl。
注意 2：由于植物多樣性非常豐富，而且同種植物的不同生長發育階段和不同組織RNA含 量都不相同，請根據具體實驗情況選擇合適的樣本量。
2．室溫，12,000 rpm(~13,400×g) 離心5 min。
3．將上清液轉移至過濾柱CS上(過濾柱CS放在收集管中)，室溫12,000 rpm(~13,400×g) 離 心2 min，小心吸取收集管中的上清至新的RNase-Free的離心管中，吸頭盡量避免接觸收 集管中的細胞碎片沉淀。
4. 量取轉移液的體積，緩慢加入轉移液體積0.43倍的C?H?O， 混勻（此時可能會出現沉淀）。將得到的溶液和沉淀一起轉入吸附柱 miRspin中，室溫 12,000 rpm (~13,400×g)離心30 sec。若一次不能全部加入到吸附柱 miRspin中，請分兩次轉入，離心后棄掉吸附柱miRspin，保留流出液。
5. 量取流出液的體積，緩慢加入流出液體積0.75倍的C?H?O，混勻（此時可能會出現沉淀）。將得到的溶液和沉淀一起轉入吸附柱CR4 中，室溫 12,000 rpm (~13,400×g)離心30 sec，若一次不能全部加入到吸附柱CR4中， 請分兩次轉入，離心后棄掉流出液，保留吸附柱CR4。
6. 向吸附柱CR4中加入700 μl去蛋白液MRD，室溫靜置2 min，室溫 12,000 rpm (~13,400×g)離心30 sec，棄廢液。
7. 向吸附柱CR4中加入500 μl漂洗液RWA（請先檢查是否已加入乙醇），室溫靜置2 min， 室溫 12,000 rpm (~13,400×g)離心30 sec，棄廢液。
8. 重復操作步驟7。
9. 將吸附柱CR4放入2 ml收集管中，室溫 12,000 rpm (~13,400×g)離心2 min，去除殘余液 體。
注意：此步驟目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，離心后將吸附柱CR4在室溫放置2 min，或置于超凈工作臺上通風片刻，以充分晾干。如果有漂洗液殘留，可能會影響后續 的RT等實驗操作。
10. 將吸附柱CR4轉入一個新的RNase-Free 1.5 ml離心管中，加50 μl RNase-Free ddH2O， 室溫放置2 min，室溫 12,000 rpm (~13,400×g)離心2 min。
注意：洗脫緩沖液體積不應少于30 μl，體積過小影響回收效率。且RNA應保存在-70℃， 以防降解。
注意：如果想提高RNA得率，可重復上步操作一次。
二、 Total RNA的提取 提取的total RNA中含有miRNA等small RNA。
對miRNA的純度要求不高時，比如在研 究miRNA RT-PCR、miRNA Northern blot時也可以采用此方法。
1. 勻漿處理 50 mg植物葉片或果實果肉在液氮中迅速研磨成粉末，轉入到1.5 ml離心管中，加入500 μl裂解液SLM ，顛倒混勻以保證裂解液浸沒所有 樣本，再加入1/10裂解液體積的助沉劑PLA ，立即渦旋震蕩混勻。
注意1：對于預期RNA得率小于10 μg的植物樣本，請使用100 mg的起始樣本量；對于富 含淀粉的樣本或成熟葉片，請將裂解液SLM用量增加至700 μl。
注意2：由于植物多樣性非常豐富，而且同種植物的不同生長發育階段和不同組織的RNA 含量都不相同，請根據具體實驗情況選擇合適的樣本量。
2. 室溫，12,000 rpm(~13,400×g) 離心5 min。
3. 將上清液轉移至過濾柱CS上(過濾柱CS放在收集管中)，12,000 rpm(~13,400×g) 離心2 min，小心吸取收集管中的上清至新的RNase-Free的離心管中，吸頭盡量避免接觸收集 管中的細胞碎片沉淀。
4．緩慢加入1.5倍上清體積的C?H?O，混勻（此時可能會出現沉淀），將得到的溶液和 沉淀一起轉入吸附柱CR4中， 12,000 rpm(~13,400×g)離心30 sec，倒掉收集管中的廢 液，將吸附柱CR4放回收集管中。
若一次不能全部轉入吸附柱CR4 ，請分兩步進行。 注意：如果上清液體積有損失，請相應調整無水乙醇的加量。
5．向吸附柱CR4中加入700 μl去蛋白液MRD(使用前請檢查是否已加入乙醇)，12,000 rpm(~13,400×g)離心30 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR4放回收集管中。
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