蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司
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天根試劑盒-細菌基因組-DP302采用離心吸附柱和緩沖液系統，既適用于革蘭氏陰性菌基因組DNA的提取，也可適用于革蘭氏陽性菌基因組DNA的提取。
天根試劑盒-細菌基因組 DP302
產品簡介
細菌基因組 DP302采用離心吸附柱和緩沖液系統，既適用于革蘭氏陰性菌基因組DNA的提取，也可適用于革蘭氏陽性菌基因組DNA的提取。
本試劑盒也可用于食品致病菌(微生物) 基因組提取，如：、霍亂弧菌、出血性大腸桿 菌O157：H7、單增李斯特、沙門氏菌、阪崎腸肝菌等。可從1-5 ml細菌培養液中，快速提取純化10-40 μg 純凈的基因組DNA，所得基因組DNA可直接用作PCR 模板、酶切、雜交等分子生物學實驗。
產品特點
■ 簡單快速：革蘭氏陰性菌在1小時內可獲得高質量的基因組DNA。
■ 質量好：DNA可直接用于PCR、酶切、雜交等分子生物學實驗。
下游應用
■ 革蘭氏陰性菌基因組提取。
■ 革蘭氏陽性菌基因組提取。
■ 食品中致病菌基因組提取。
自備試劑
( 革蘭氏陽性菌)、緩沖液(20 mM Tris, pH8.0; 2 mM Na2-EDTA; 1.2%Triton-100 )
注意事項
請務必在使用本試劑盒之前閱讀此注意事項。
1．樣品應避免反復凍融，否則會導致提取的DNA片段較小且提取量也下降。
2．若緩沖液GA或GB中有沉淀，可在37℃水浴中重新溶解，并搖勻后使用。
3．所有的離心步驟均為使用臺式離心機，室溫下離心。
操作步驟 使用前請先在緩沖液GD和漂洗液PW中加入CH3CH2OH，加入體積請參照瓶上的標簽。
1. 取細菌培養液1-5 ml，10,000 rpm(~11,500×g)離心1 min，盡量吸凈上清。
2. 向菌體沉淀中加入200 μl緩沖液GA，振蕩至菌體懸浮。
注意：對于較難破壁的革蘭氏陽性菌，可略過第2步驟，加入溶液進行破壁處 理。
具體方法為：加入110 µl緩沖液（20 mM Tris, pH 8.0；2 mM Na2-EDTA；1.2% Triton），和70 µl溶液（50 mg/ml，客戶自備，目錄號：RT401），37 ℃處理30 min以上。如果需要去除RNA，可加入4 μl RNase A（100 mg/ml）溶液（客戶自備，目 錄號：RT405-12），振蕩15 sec，室溫放置5 min。
3. 向管中加入20 μl Proteinase K溶液，混勻。
4. 加入220 μl緩沖液GB，振蕩15 sec，70 ℃放置10 min，溶液應變清亮，簡短離心以去除 管蓋內壁的水珠。
注意：加入緩沖液GB時可能會產生白色沉淀，一般70℃放置時會消失，不會影響后續實 驗。
如溶液未變清亮，說明細胞裂解不，可能導致提取DNA量少和提取出的DNA不 純。
5. 加220 μl CH3CH2OH，充分振蕩混勻15 sec，此時可能會出現絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠。
6. 將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中）， 12,000 rpm (~13,400×g ) 離心30 sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
7. 向吸附柱CB3中加入500 μl緩沖液GD，12,000 rpm (~13,400×g ) 離心30 sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
8. 向吸附柱CB3中加入600 μl漂洗液PW，12,000 rpm (~13,400×g ) 離心30 sec，倒掉廢液，吸附柱CB3放入收集管中。
9. 重復操作步驟8。
10. 將吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm(~13,400×g)離心2 min，倒掉廢液。
將吸附柱 CB3置于室溫放置數分鐘，以晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，漂洗液中的殘留會影響后續的酶反應（酶切、PCR等）實驗。
11. 將吸附柱CB3轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200 μl洗脫緩 沖液TE，室溫放置2-5 min，12,000 rpm (~13,400×g ) 離心2 min，將溶液收集到離心管 中。
注意：洗脫緩沖液體積不應少于50 μl，體積過小影響回收效率。洗脫液的pH值對于 洗脫效率有較大影響。
若用ddH2O做洗脫液應保證其pH值在7.0-8.5范圍內，pH值低 于7.0會降低洗脫效率；且DNA產物應保存在-20℃，以防DNA降解。
為增加基因組 DNA的得率，可將離心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室溫放置2 min，12,000 rpm(~13,400×g )離心2 min。
DNA濃度及純度檢測
得到的基因組DNA片段的大小與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關。回收得到的DNA片段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。 DNA應在OD260處有吸收峰，OD260值為1相當于大約50 μg/ml雙鏈DNA、40 μg/ml 單鏈DNA。 OD260/OD280比值應為1.7-1.9，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用ddH2O，比值會偏 低，因為pH值和離子存在會影響光吸收值，但并不表示純度低。
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