簡介
3D 生物打印被定義為細胞和生物相容性材料功能性 3D 結構或人工組織模型。1 這項技術改變了組織工程領域，使得創建復雜的預定義設計的結構成為可能，同時確保可重復性。幾種基于 3D 生物打印的方法已報告用于工程化各種組織，如軟骨、2 骨、3 以及皮膚再生。4 該技術也被用于創造新的臨床前腫瘤模型。事實上，作為 2D 細胞培養模型由于缺乏預測性而受到越來越多的質疑， 3D 生物打印已成為一種替代方法通過處理不同的細胞和細胞外基質衍生分子，腫瘤微環境的建模 / 展示 (TME) 來規避這個問題。許多基于 3D 生物打印的腫瘤模型包括肺癌、5 乳腺癌和 6 膠質母細胞瘤。7 這些模型在設計方面表現出優勢，與其他策略相比具有靈活性和可重復性如 細胞球和類器官。 卵巢癌是一個重大的公共衛生問題，3D 生物打印仍作為 卵巢癌模型仍在研究中。在此類腫瘤類型中，顯示癌癥相關成纖維細胞 (CAF) 與癌細胞發生密切相互作用，在癌癥侵襲和耐藥中發揮主要作用。8，9 因此 CAFs 是設計卵巢癌模型的關鍵。
優勢
高內涵篩選和瞬時轉染有助于表征和驗證 3D 生物打印實驗 • 瞬時基因表達是增加 3D 生物打印模型的多功能性的有力工具 • 多波長分析工具對于充分利用 3D 生物打印模型的強大功能進行研究不同細胞類型群體在模型內的相互作用是必需的在此應 用說 明 中，3D 生物打印用于創建包含癌細胞 ( SKOV3 細胞 ) 和 CAF 成纖維細胞 ( MeWo 細胞 ) 的卵巢癌模型。使用 jetOPTIMUS (Polyplus) GFP 質粒轉染 SKOV3 細胞和并用 CellTracker 和 Orange CMRA Dye (ThermoFisher) 將 MeWo 細胞染色。兩種細胞類型均包含在明膠 - 藻酸鹽 - 基于水凝膠以獲得用于形成圓柱形腫瘤樣結構。模型的均相性以及這些腫瘤內細胞分布的可重復性，使用 ImageXpress Pico 進行評估成像系統。
結果和討論
如圖 1 所示，生物打印結構成像顯示表達 GFP 的 SKOV3 細胞和熒光染色的 MeWo 細胞均質分布于明膠 - 藻酸鹽 基體 ( 圖 1A 和 B )。這非常重要，因為同質細胞分布均勻分布在生物墨水中是 3D 打印過程中需要考慮的重要因素 12 此外，天然 TME 是已知包含多種緊密相互作用的細胞類型。13 因此，重現這一點至關重要，同時構建體外腫瘤模型以促進癌癥和基質細胞之間的相互作用。
而腫瘤中應結合多種細胞類型以更好地模擬 TME 異質 性，每種細胞類型的數量及其比例需要加以控制以確保可重復性。ImageXpress Pico 是一個特別適合用于實現此類控制，因其可以快速輕松地捕獲多張顯微鏡圖像。 軟件 CellReporterXpress 允許對多個細胞進行定量即使是厚樣品，也可使用 Z-stack 的最大投影實現。在此應用說明中，此系統用于分析我們的生物打印腫瘤模型在細胞數量和比例方面顯示出良好的可重復性在 6 個生物打 印的結構，SKOV3 細胞的平均數量 ( 細胞計數 FITC ) 為 837 ± 200 ( 標準差 ≤ 25% )。對于 MeWo 細胞 ( 細胞計 數 TRITC )，平均數量為 3264.50 ± 462 (StD ≤ 15%)。
材料和方法
水凝膠制備
對于水凝膠制備，所需質量的對明膠和海藻酸鈉粉末進行稱重，在紫外線下 1 小時，然后溶解在 Dulbecco 改 良 EagleMedium 中混合lowest必需培養基 (MEM)，補充有 10% 胎牛血清。所得溶液為然后在磁力攪拌下在 37℃ 下 保持過夜，complete均質化。 細胞轉染和染色根據制造商的說明，使 用 jetOPTIMUS (Polyplus) GFP 質粒轉染 SKOV3 細胞。10 簡言之，適量的 DNA 稀釋至 jetOPTIMUS 緩沖液并適當的加入 jetOPTIMUS 轉染試 劑。轉染溶液在室溫下保存 10 分鐘，然后添加到培養的 SKOV3 細胞中，以 60–80% 融合度培養在 T75 燒瓶中。 使 用 CellTracker Orange CMRA 染 料 (ThermoFisher) 對 MeWO 細胞進行染色，按照制造商的說明。11 簡言 之，將染料溶解在 DMSO 中制備工作溶液，然后稀釋在 MEM 培養基中。將細胞在 37℃ 孵育 30 分鐘。 然后取出試劑溶液，替換為新鮮的complete培養基。
將制備好的生物墨水裝入 3 mL 濾芯中并裝入生物打印 頭。生物打印在 24 孔板中進行。每個 3 毫升濾芯生物打 大約 48 種結構。生物打印后，使用 100 mM CaCl2 溶液 交聯結構，補充新鮮培養基并在 37℃ 和 5% CO2 條件下 培養，直至實驗。
細胞成像
將生物打印結構轉移到 96 孔板中 ( Greiner 655892，玻 璃底，黑壁 )。 使用 ImageXpress Pico 自動細胞成像系統，使用 4X 物 鏡對細胞進行成像。 通過透射光、FITC 和 TRITC 通 道 分 別以 5、150 和 250 ms 曝光時間在每個孔采集圖像。4X 物鏡顯示約占孔總 面積的 40%。采用基于硬件和基于圖像的自動對焦相結 合的方法，獲 得了距離為 50 μm 的 7 個 Z 平面 (Z 層疊 加 )。最大二維投影圖像是實時生成的。 Cell ReporterXpress 軟件中預先配置的細胞計數分析模 塊用于在 FITC 或 TRITC 通道中使用信號量化細胞。用 于分析的分割參數為強度、最小值和最大寬度。FITC 通 道的值為 23,7,100,TRITC 通道為 23,7,38。
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