‘寬場(chǎng)顯微鏡’是最基本的顯微鏡技術(shù)之一。其根本上是將整個(gè)感興趣的樣本暴露于光源下，由觀察者或攝像頭（也可連接到計(jì)算機(jī)顯示器）獲得圖像的技術(shù)。
寬場(chǎng)與共聚焦顯微鏡的基本比較
在寬場(chǎng)顯微鏡中，顯微鏡載物臺(tái)上的整個(gè)樣本將暴露于光源。最基本的寬場(chǎng)顯微鏡檢查形式是“明場(chǎng)顯微鏡檢查”。
在共聚焦激光掃描顯微鏡中，用于激發(fā)熒光染料和蛋白質(zhì)熒光的光源來(lái)自激光單元，該單元是整個(gè)共聚焦系統(tǒng)的組成部分。共聚焦顯微鏡檢查的主要優(yōu)勢(shì)是可選擇用戶定義的感興趣區(qū)域，而無(wú)需將整個(gè)樣本暴露于熒光光源。另外，共聚焦顯微鏡可用于通過(guò)樣本獲得的光學(xué)切片，其優(yōu)勢(shì)在于可排除大部分失焦或背景熒光。
標(biāo)準(zhǔn)寬場(chǎng)顯微鏡沒有共聚焦顯微鏡復(fù)雜，通常包括白色和熒光光源、顯微鏡和攝像頭（有或沒有連接的計(jì)算機(jī)）。在共聚焦系統(tǒng)中，顯微鏡本身只是配置的一部分，包括激光單元、共聚焦‘掃描頭’（包含用于排除失焦光的針孔和用于從樣本中收集光子的光電倍增管）和用于控制系統(tǒng)中多個(gè)參數(shù)以及圖像處理的計(jì)算機(jī)。
比較寬場(chǎng)和共聚焦顯微鏡的光源
在傳統(tǒng)的激光掃描共聚焦顯微鏡中，可能需要大約五種不同的激光源來(lái)覆蓋常用熒光團(tuán)的激發(fā)波長(zhǎng)。例如，常用激光器為氬離子激光器，其可以產(chǎn)生一系列由濾光片選擇的激發(fā)波長(zhǎng)。氬離子激光器覆蓋了激發(fā)光譜的綠色波長(zhǎng)，并用于激發(fā)熒光團(tuán)，如FITC（異硫氰酸熒光素）。激發(fā)光譜的黃色至紅色波長(zhǎng)被氦-氖激光覆蓋，范圍為約543至632nm。該光譜用于激發(fā)熒光團(tuán)，如德克薩斯紅和羅丹明。
在發(fā)光二極管（LED）作為寬場(chǎng)顯微鏡的熒光激發(fā)光源引入之前，激發(fā)光的主要來(lái)源為氣弧光燈，這些燈至今仍廣泛使用。寬場(chǎng)顯微鏡中常見的兩種弧光燈為汞弧燈（也稱為“汞燃燒器”或“汞蒸汽燈”）和氙弧燈。汞弧燈在大部分可見光譜中提供激發(fā)波長(zhǎng)（見圖2），然而，這種照明不均勻，主峰位于近紫外（UV）波長(zhǎng)（313 nm、334 nm、365 nm、405 nm、436 nm）內(nèi)，另外兩個(gè)峰在546和579 nm處的光譜綠色/黃色部分。
與汞弧燈相比，氙弧燈在大部分可見光譜中提供激發(fā)波長(zhǎng)，但該范圍內(nèi)的峰值不會(huì)達(dá)到汞燃燒器的強(qiáng)度。盡管與汞燃燒器相比，氙弧燈未擴(kuò)展到光譜的紫外線部分，但其激發(fā)范圍進(jìn)一步進(jìn)入紅外波長(zhǎng)。
雖然這些燈為熒光顯微鏡提供了的光源，但其也存在固有問(wèn)題。這些燈泡的壽命有限，汞燃燒器通常持續(xù)200至300小時(shí)，氙弧燈持續(xù)400至600小時(shí)。由于其使用壽命有限，顯微鏡應(yīng)仔細(xì)記錄使用的小時(shí)數(shù)（盡管一些系統(tǒng)內(nèi)置了使用小時(shí)數(shù)記錄器）。如果氣弧光燈在其推薦的壽命范圍內(nèi)用完，則存在管爆炸的危險(xiǎn)。此外，如果經(jīng)常接通/關(guān)閉燈，會(huì)顯著縮短燈泡壽命，因此需要考慮這一點(diǎn)。需要仔細(xì)處置使用過(guò)的弧光燈，并應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室各自的規(guī)定進(jìn)行處置。
用于顯微鏡的新一代LED光源不僅提供全光譜的激發(fā)波長(zhǎng)（約365至770 nm），且強(qiáng)度與弧光燈相當(dāng)。與弧光燈相比，其主要優(yōu)點(diǎn)是LED光源的壽命可長(zhǎng)達(dá)50,000小時(shí)，無(wú)需預(yù)熱或冷卻時(shí)段。這也可以節(jié)省時(shí)間，因?yàn)長(zhǎng)ED單元僅需要在最初安裝時(shí)進(jìn)行一次對(duì)準(zhǔn)調(diào)整。最后，廢熱是弧光燈的一個(gè)問(wèn)題，因此將其安裝在顯微鏡旁邊的特殊外殼中。由于LED燈的大部分電氣輸入轉(zhuǎn)換為光，其實(shí)際上不會(huì)產(chǎn)生廢熱。
比較寬場(chǎng)和共聚焦顯微鏡的圖像捕獲
如上所述，共聚焦掃描頭包含一系列光電倍增管（PMT），用于從樣本中收集光子。共聚焦掃描頭通常包含至少三個(gè)PMT，負(fù)責(zé)收集紅光、綠光和藍(lán)光，但也會(huì)使用額外的PMT收集透射光或反射光。PMT不是攝像頭，而是由真空管組成，真空管的一端有光子進(jìn)入窗口，管體內(nèi)有電子倍增元件。在最終組裝并顯示圖像之前，將收集的光子量轉(zhuǎn)換為電信號(hào)。許多共聚焦系統(tǒng)還配備了類似于寬場(chǎng)顯微鏡所用的攝像頭。
基于光電二極管的傳統(tǒng)攝像頭有助于寬場(chǎng)顯微鏡中的圖像捕獲。數(shù)字顯微鏡攝像頭包含半導(dǎo)體檢測(cè)器，見的傳感器是電荷耦合器件（CCD）、互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體（CMOS）和sCMOS（科學(xué)CMOS）。CCD和CMOS攝像頭有許多相似之處，盡管它們以不同的方式處理圖像信號(hào)，這會(huì)影響攝像頭的捕捉時(shí)間以及信噪比等因素。由于其功能的固有性質(zhì)，基于CCD的攝像頭的幀速率可能比CMOS傳感器慢10倍。因此，攝像頭的選擇取決于感興趣樣本的動(dòng)態(tài)性質(zhì)。
寬場(chǎng)顯微鏡的配置
寬場(chǎng)顯微鏡要么是正置式，從下方照射玻片，要么是倒置式，從上方照射玻片，如圖5所示。該配置對(duì)待研究的樣本有影響。正置顯微鏡通常用于安裝在玻片上的固定樣本。倒置顯微鏡用于觀察活細(xì)胞。它們通常在液體溶液中生長(zhǎng)。只有物鏡位于樣本下方且聚光器位于樣本上方的配置才能保證物鏡與樣本足夠接近。
透射照明技術(shù)包括相位對(duì)比度和微分干涉對(duì)比度（DIC）等對(duì)比度方法。然而，透射熒光顯微鏡檢查是一種既不為人所知也未廣泛使用的方法。該方法不使用雙色透鏡，而是激光法穿過(guò)聚光器和樣本，并通過(guò)物鏡收集發(fā)射光。然而，該技術(shù)存在許多初始問(wèn)題，如背景水平高以及聚光器和物鏡光學(xué)匹配困難[1]。進(jìn)展克服了這些問(wèn)題，使得透射熒光成像可用于體內(nèi)成像和牙科研究等區(qū)域[2]。
寬場(chǎng)顯微鏡的對(duì)比度方法
顯微鏡檢查的對(duì)比度方法包括微分干涉對(duì)比度（DIC）和相位對(duì)比度顯微鏡檢查，可與寬場(chǎng)熒光顯微鏡檢查結(jié)合使用。
將寬場(chǎng)熒光顯微鏡檢查與對(duì)比度技術(shù)相結(jié)合，可提供有價(jià)值的生存力和形態(tài)學(xué)信息和圖像。共聚焦系統(tǒng)能夠同時(shí)捕捉可使用圖像分析軟件疊加的對(duì)比度和熒光圖像。然而，在寬場(chǎng)熒光顯微鏡中，同時(shí)成像需要使用分視圖攝像頭適配器或使用兩個(gè)單獨(dú)的攝像頭，一個(gè)用于對(duì)比度，一個(gè)用于熒光。
更常見的情況是，通過(guò)攝像頭捕捉熒光圖像，然后將光學(xué)器件更換為對(duì)比度照明，然后由相同的攝像頭捕捉對(duì)比度圖像。然后可使用圖像分析軟件對(duì)這些圖像進(jìn)行合并。
寬場(chǎng)顯微鏡的分辨率
顯微鏡的分辨率簡(jiǎn)單理解是區(qū)分樣本細(xì)節(jié)的能力。這是樣本的兩個(gè)不同點(diǎn)仍可被視為獨(dú)立實(shí)體的最小距離。有關(guān)決定分辨率的概念和因素的更多信息，請(qǐng)閱讀此處。
與所有傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡系統(tǒng)（包括共聚焦）一樣，分辨率取決于數(shù)值孔徑（NA）和光波長(zhǎng)。在光學(xué)顯微鏡中，分辨率極限約為200 nm。在具有NA光學(xué)元件的*對(duì)準(zhǔn)顯微鏡系統(tǒng)中，分辨率極限大約是用于對(duì)樣本成像的光波長(zhǎng)的一半（或激發(fā)熒光團(tuán)）。在將寬場(chǎng)與共聚焦顯微鏡進(jìn)行比較時(shí)，兩種方法中的理論分辨率極限相似。
然而，背景熒光會(huì)降低寬場(chǎng)顯微鏡獲得的實(shí)際分辨率。如上所述，整個(gè)樣本在寬場(chǎng)顯微鏡下照亮，因此焦平面上方和下方的區(qū)域也將發(fā)出熒光，通過(guò)攝像頭捕捉并被觀察者看到。因此，這種背景熒光會(huì)稍微掩蓋來(lái)自熒光團(tuán)的發(fā)射波長(zhǎng)，導(dǎo)致信噪比總體降低，且隨后可實(shí)現(xiàn)的分辨率和對(duì)比度降低。
在共聚焦系統(tǒng)中，（掃描頭內(nèi)的）針孔用于阻擋任何失焦光到達(dá)PMT檢測(cè)器。盡管這具有通過(guò)阻擋背景和自動(dòng)熒光產(chǎn)生清晰聚焦圖像的優(yōu)點(diǎn)，但一些失焦光子可能來(lái)自焦平面。這意味著一些信息可能會(huì)因針孔而丟失。共聚焦系統(tǒng)上產(chǎn)生的清晰圖像與寬場(chǎng)顯微鏡無(wú)意中收集的失焦光之間存在平衡。但是，使用一種稱為“反卷積”的采集后處理方法，可解決模糊和聚焦問(wèn)題。該計(jì)算過(guò)程可將光子重新分配到其原點(diǎn)。
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