‘寬場顯微鏡’是最基本的顯微鏡技術之一。其根本上是將整個感興趣的樣本暴露于光源下，由觀察者或攝像頭（也可連接到計算機顯示器）獲得圖像的技術。
寬場與共聚焦顯微鏡的基本比較
在寬場顯微鏡中，顯微鏡載物臺上的整個樣本將暴露于光源。最基本的寬場顯微鏡檢查形式是“明場顯微鏡檢查”。
在共聚焦激光掃描顯微鏡中，用于激發(fā)熒光染料和蛋白質熒光的光源來自激光單元，該單元是整個共聚焦系統的組成部分。共聚焦顯微鏡檢查的主要優(yōu)勢是可選擇用戶定義的感興趣區(qū)域，而無需將整個樣本暴露于熒光光源。另外，共聚焦顯微鏡可用于通過樣本獲得的光學切片，其優(yōu)勢在于可排除大部分失焦或背景熒光。
標準寬場顯微鏡沒有共聚焦顯微鏡復雜，通常包括白色和熒光光源、顯微鏡和攝像頭（有或沒有連接的計算機）。在共聚焦系統中，顯微鏡本身只是配置的一部分，包括激光單元、共聚焦‘掃描頭’（包含用于排除失焦光的針孔和用于從樣本中收集光子的光電倍增管）和用于控制系統中多個參數以及圖像處理的計算機。
比較寬場和共聚焦顯微鏡的光源
在傳統的激光掃描共聚焦顯微鏡中，可能需要大約五種不同的激光源來覆蓋常用熒光團的激發(fā)波長。例如，常用激光器為氬離子激光器，其可以產生一系列由濾光片選擇的激發(fā)波長。氬離子激光器覆蓋了激發(fā)光譜的綠色波長，并用于激發(fā)熒光團，如FITC（異硫氰酸熒光素）。激發(fā)光譜的黃色至紅色波長被氦-氖激光覆蓋，范圍為約543至632nm。該光譜用于激發(fā)熒光團，如德克薩斯紅和羅丹明。
在發(fā)光二極管（LED）作為寬場顯微鏡的熒光激發(fā)光源引入之前，激發(fā)光的主要來源為氣弧光燈，這些燈至今仍廣泛使用。寬場顯微鏡中常見的兩種弧光燈為汞弧燈（也稱為“汞燃燒器”或“汞蒸汽燈”）和氙弧燈。汞弧燈在大部分可見光譜中提供激發(fā)波長（見圖2），然而，這種照明不均勻，主峰位于近紫外（UV）波長（313 nm、334 nm、365 nm、405 nm、436 nm）內，另外兩個峰在546和579 nm處的光譜綠色/黃色部分。
與汞弧燈相比，氙弧燈在大部分可見光譜中提供激發(fā)波長，但該范圍內的峰值不會達到汞燃燒器的強度。盡管與汞燃燒器相比，氙弧燈未擴展到光譜的紫外線部分，但其激發(fā)范圍進一步進入紅外波長。
雖然這些燈為熒光顯微鏡提供了的光源，但其也存在固有問題。這些燈泡的壽命有限，汞燃燒器通常持續(xù)200至300小時，氙弧燈持續(xù)400至600小時。由于其使用壽命有限，顯微鏡應仔細記錄使用的小時數（盡管一些系統內置了使用小時數記錄器）。如果氣弧光燈在其推薦的壽命范圍內用完，則存在管爆炸的危險。此外，如果經常接通/關閉燈，會顯著縮短燈泡壽命，因此需要考慮這一點。需要仔細處置使用過的弧光燈，并應根據實驗室各自的規(guī)定進行處置。
用于顯微鏡的新一代LED光源不僅提供全光譜的激發(fā)波長（約365至770 nm），且強度與弧光燈相當。與弧光燈相比，其主要優(yōu)點是LED光源的壽命可長達50,000小時，無需預熱或冷卻時段。這也可以節(jié)省時間，因為LED單元僅需要在最初安裝時進行一次對準調整。最后，廢熱是弧光燈的一個問題，因此將其安裝在顯微鏡旁邊的特殊外殼中。由于LED燈的大部分電氣輸入轉換為光，其實際上不會產生廢熱。
比較寬場和共聚焦顯微鏡的圖像捕獲
如上所述，共聚焦掃描頭包含一系列光電倍增管（PMT），用于從樣本中收集光子。共聚焦掃描頭通常包含至少三個PMT，負責收集紅光、綠光和藍光，但也會使用額外的PMT收集透射光或反射光。PMT不是攝像頭，而是由真空管組成，真空管的一端有光子進入窗口，管體內有電子倍增元件。在最終組裝并顯示圖像之前，將收集的光子量轉換為電信號。許多共聚焦系統還配備了類似于寬場顯微鏡所用的攝像頭。
基于光電二極管的傳統攝像頭有助于寬場顯微鏡中的圖像捕獲。數字顯微鏡攝像頭包含半導體檢測器，見的傳感器是電荷耦合器件（CCD）、互補金屬氧化物半導體（CMOS）和sCMOS（科學CMOS）。CCD和CMOS攝像頭有許多相似之處，盡管它們以不同的方式處理圖像信號，這會影響攝像頭的捕捉時間以及信噪比等因素。由于其功能的固有性質，基于CCD的攝像頭的幀速率可能比CMOS傳感器慢10倍。因此，攝像頭的選擇取決于感興趣樣本的動態(tài)性質。
寬場顯微鏡的配置
寬場顯微鏡要么是正置式，從下方照射玻片，要么是倒置式，從上方照射玻片，如圖5所示。該配置對待研究的樣本有影響。正置顯微鏡通常用于安裝在玻片上的固定樣本。倒置顯微鏡用于觀察活細胞。它們通常在液體溶液中生長。只有物鏡位于樣本下方且聚光器位于樣本上方的配置才能保證物鏡與樣本足夠接近。
透射照明技術包括相位對比度和微分干涉對比度（DIC）等對比度方法。然而，透射熒光顯微鏡檢查是一種既不為人所知也未廣泛使用的方法。該方法不使用雙色透鏡，而是激光法穿過聚光器和樣本，并通過物鏡收集發(fā)射光。然而，該技術存在許多初始問題，如背景水平高以及聚光器和物鏡光學匹配困難[1]。進展克服了這些問題，使得透射熒光成像可用于體內成像和牙科研究等區(qū)域[2]。
寬場顯微鏡的對比度方法
顯微鏡檢查的對比度方法包括微分干涉對比度（DIC）和相位對比度顯微鏡檢查，可與寬場熒光顯微鏡檢查結合使用。
將寬場熒光顯微鏡檢查與對比度技術相結合，可提供有價值的生存力和形態(tài)學信息和圖像。共聚焦系統能夠同時捕捉可使用圖像分析軟件疊加的對比度和熒光圖像。然而，在寬場熒光顯微鏡中，同時成像需要使用分視圖攝像頭適配器或使用兩個單獨的攝像頭，一個用于對比度，一個用于熒光。
更常見的情況是，通過攝像頭捕捉熒光圖像，然后將光學器件更換為對比度照明，然后由相同的攝像頭捕捉對比度圖像。然后可使用圖像分析軟件對這些圖像進行合并。
寬場顯微鏡的分辨率
顯微鏡的分辨率簡單理解是區(qū)分樣本細節(jié)的能力。這是樣本的兩個不同點仍可被視為獨立實體的最小距離。有關決定分辨率的概念和因素的更多信息，請閱讀此處。
與所有傳統光學顯微鏡系統（包括共聚焦）一樣，分辨率取決于數值孔徑（NA）和光波長。在光學顯微鏡中，分辨率極限約為200 nm。在具有NA光學元件的*對準顯微鏡系統中，分辨率極限大約是用于對樣本成像的光波長的一半（或激發(fā)熒光團）。在將寬場與共聚焦顯微鏡進行比較時，兩種方法中的理論分辨率極限相似。
然而，背景熒光會降低寬場顯微鏡獲得的實際分辨率。如上所述，整個樣本在寬場顯微鏡下照亮，因此焦平面上方和下方的區(qū)域也將發(fā)出熒光，通過攝像頭捕捉并被觀察者看到。因此，這種背景熒光會稍微掩蓋來自熒光團的發(fā)射波長，導致信噪比總體降低，且隨后可實現的分辨率和對比度降低。
在共聚焦系統中，（掃描頭內的）針孔用于阻擋任何失焦光到達PMT檢測器。盡管這具有通過阻擋背景和自動熒光產生清晰聚焦圖像的優(yōu)點，但一些失焦光子可能來自焦平面。這意味著一些信息可能會因針孔而丟失。共聚焦系統上產生的清晰圖像與寬場顯微鏡無意中收集的失焦光之間存在平衡。但是，使用一種稱為“反卷積”的采集后處理方法，可解決模糊和聚焦問題。該計算過程可將光子重新分配到其原點。
