圖1. Ras/Raf/MEK/ERK信號級聯將信號從細胞表面受體如EGF受體（EGFR）傳播到細胞內蛋白質。ERK是該途徑的終組分，并且在被生長因子（例如EGF（表皮生長因子））激活后，觸發下游效應，如激酶或轉錄因子的激活。
該途徑被不同類型的受體激活，包括受體酪氨酸激酶 （例如EGF受體）以及G蛋白偶聯受體。作為信號傳導途徑的終組分，ERK磷酸化不同的細胞內蛋白質，包括大量其他激酶和轉錄因子。ERK信號傳導途徑存在于各種癌癥類型中，因此正在研究作為治療干預的靶標。
在這里，我們描述了如何在Operetta CLS高內涵分析系統上自動化研究ERK信號傳導的活細胞FRET測定。該測定可以用于藥物發現。
基于FRET的ERK生物傳感器
FRET是從供體分子到受體分子的非輻射能量轉移。能量轉移需要供體和受體間隔小于10nm，因此提供了研究分子接近度變化的敏感工具，例如蛋白質 - 蛋白質相互作用（分子間FRET）或蛋白質的構象變化（分子內FRET）。在這項研究中，我們專注于分子內FRET，使用稱為EKAREV的CFP-YFP生物傳感器（圖2）。穩定表達EKAREV的細胞由Somponnat Sampattavanich博士友情提供（圖3）。在該生物傳感器中，供體和受體熒光團以單一融合蛋白編碼。EKAREV生物傳感器經過優化，可以減少隨機觸發的基礎FRET信號，并使其可靠地與距離相關。ERK對EKAREV的磷酸化觸發構象變化，使CFP和YFP靠近誘導FRET。
圖2.細胞外信號調節激酶活性報告基因（EKAREV）的示意圖。在該生物傳感器中，兩種熒光蛋白通過ERK底物結構域，接頭和結合結構域分開。一旦ERK底物結構域經過ERK的磷酸化，就會觸發構象變化，使CFP和YFP緊密接近并允許FRET發生。
EKAREV生物傳感器是分子內FRET的實例，其中供體和受體以1：1的固定化學計量存在。因此，進行雙通道比率實驗就足夠了，通道1檢測受體發射光(
IAcceptor)，通道2檢測供體發射光(IDonor)，將得到的兩個熒光信號強度進行背景校正，并計算它們的比率以給出相對FRET效率EFRET:
將1.2×104EKAREV細胞/孔接種到CellCarrier-96Ultra微量培養板（PerkinElmer＃6055300），150μl培養基（表1）中。孵育2天后（37℃，5％CO2），150μl饑餓培養基洗滌兩次并在饑餓培養基中孵育5小時以降低基礎ERK活性。另外，在孵育開始時向細胞中加入各種濃度的抑制劑或DMSO。4.5小時后，將細胞核用4μM DRAQ5在37℃，5％CO2下染色30分鐘。然后用饑餓培養基洗滌細胞一次，并加入含有8μl 20x濃縮抑制劑或DMSO對照的150μl新鮮饑餓培養基。作為對照，在某一時間點，向細胞中加入8μl20x濃縮誘導物（PMA或EGF）。為了抑制FRET信號，應用PD184352，SCH772984和Ulixertinib。含有或不含有所測試化合物的DMSO濃度的培養基用作對照。
成像
在寬場模式下使用20x高NA物鏡（NA 0.8）在Operetta CLS系統上建立長時間實驗，獲取圖像總共97分鐘。將FRET誘導化合物添加到血清饑餓細胞后，開始時間序列，測量間隔為每8分鐘一次，在此設置中獲得了四個渠道：DRAQ5 （ex 615-645，em655-760），CFP（ex 435-460，em 470-515），YFP（ex490-515，em 525-580）和FRET（ex 435-460，em 515-580）（圖3）。
分析策略
使用Harmony®高內涵成像和分析軟件進行自動圖像分析。簡言之，將圖像分割成細胞和背景。計算細胞質和背景中的供體和FRET強度，然后計算背景校正的FRET比率作為終結果（圖4）。
圖4.使用Harmony軟件進行比率FRET定量的圖像分析工作流程：細胞和背景的細胞質被分段，低表達細胞被強度閾值排除。量化供體和FRET通道的強度及其適當的背景，并計算背景校正的FRET強度比。減去背景強度在活細胞應用中尤其有利，其中具有自發熒光組分的培養基通常導致更高的背景并因此導致更小的測定窗口。
結果
為了探索是否可以使用基于FRET的生物傳感器在Operetta CLS上研究ERK信號傳導的調節，用不同的ERK和MEK激活劑和抑制劑處理EKAREV細胞。（圖5）。
圖5.外源添加的活化劑（綠色）和抑制劑（紅色）示意圖及其對ERK信號通路的影響。表達EKAREV的細胞用EGF或PMA處理以誘導ERK活化，另外，用三種MEK和ERK特異性抑制劑（PD184352，SCH772984，Ulixertinib），在途徑的不同位置中斷信號轉導。
PMA和EGF充當Ras/Raf/MEK/ERK信號級聯的特異性激活劑。EGF特異性結合細胞表面上的EGF受體，而PMA作為親脂性，膜可滲透的分子通過直接激活RAF激活該途徑。PD184352可以通過選擇性抑制MEK1/2來抑制ERK途徑，而Ulixertinib和SCH772984都是ERK1/2的有效和選擇性抑制劑。
首先，為了更多地了解FRET誘導和抑制的動態性質，記錄了97分鐘的長時實驗。正如所料，與未處理的對照相比，單獨用EGF或PMA處理細胞導致FRET比率的強烈增加（圖6）。大約30分鐘后信號處于高位。對照顯示較低水平的ERK活化，并且觀察到隨時間穩定增加。由于ERK1/2可以通過多種生長因子和有絲分裂來調節，這可能是由活細胞成像過程中的自分泌或旁分泌信號引起的。用不同濃度的ERK抑制劑（SCH772984）共同處理細胞導致ERK反應的劑量依賴性降低。在5μMSCH772984中，通過EGF的ERK活化幾乎可以忽略不計，表明在該濃度下ERK被*抑制。請注意，0.5％DMSO是實驗中使用的濃度，確實對FRET比率有影響，因此需要包括此對照。用第二種ERK1/2特異性抑制劑Ulixertinib獲得了類似的結果（數據未顯示）。
圖6.在Operetta CLS系統上使用基于EKAREV FRET的生物傳感器的ERK信號傳導的時間進程。通過EGF或PMA刺激ERK誘導快速FRET信號增加，在約30分鐘后平穩。高濃度的SCH772984（5μM）導致幾乎*抑制ERK活化（1μg/ ml EGF），沒有可測量的FRET信號增加。較高稀釋度的SCH772984僅部分抑制EGF誘導的ERK活化。control顯示沒有任何處理的樣品有中間輕微上升的FRET信號。0.5％DMSO略微抑制FRET信號，這是實驗中使用的DMSO的濃度。測定統計：Z'= 0.87（在時間點32分鐘計算，DMSO為陰性，EGF為陽性對照）
當FRET信號在32分鐘后達到恒定水平時，選擇該時間點以確定SCH772984的IC50值。用1μg/ mL EGF和系列稀釋的SCH772984處理EKAREV細胞，稀釋范圍為10pM至3μM。計算的IC50值為272nM的劑量反應曲線如圖7所示。
圖7.ERK抑制劑SCH772984導致基于FRET的EKAREV信號的劑量依賴性降低。在1μg/ ml EGF存在下，用遞增濃度的SCH772984處理EKAREV細胞。在孵育32分鐘后，在Operetta CLS系統上測定FRET比率，因為信號在此時間點穩定。高Z'值（Z'= 0.89）顯示出優異的分析性能。
為了研究EKAREV FRET成像測定是否可用于研究直接作用于MEK1/2的途徑調節，測試了MEK1/2抑制劑PD184352對PMA化細胞的作用（圖8）。如圖所示，PD184352抑制PMA誘導的ERK活化。
圖8.在Operetta CLS系統上測量的PD184352對PMA活化的Ras/Raf/MEK/ERK信號級聯的抑制。EKAREV細胞用另一組活化劑和抑制劑（PMA+PD184352）處理，其作用在RAF/MEK的上游（與圖5比較）。用200或2000nM PMA處理的EKAREV細胞顯示出高FRET反應（誘導后32分鐘）。通過將細胞與MEK1/2特異性抑制劑PD184352以10μM的濃度共孵育來抑制活化。
結論
EKAREV FRET生物傳感器可用于Operetta CLS系統的活細胞成像測定，以研究ERK的激活和抑制。級聯內不同靶標的調節很容易測量，因此這種方法可以有助于鑒定干擾Ras/Raf/MEK/ERK信號級聯的新化合物。該測定在活細胞中進行，因此它可用于分析ERK信號傳導動力學，而定量ERK磷酸化的常規生物化學技術通常是終點測定。盡管細胞群中生物傳感器表達水平相對不均勻（圖3），但FRET比率的計算提供了特別好的化驗數據和統計數據，Z'值高于0.87。
EKAREV生物傳感器的優化設計，Operetta CLS系統的高質量成像以及Harmony內圖像分析的出色工具都有助于提高這里提供的高含量FRET分析的穩定性。Harmony軟件的構建模塊概念允許創建易于設置和理解的圖像分析序列，并且不需要專業的圖像分析知識。該測定還提供了Opera Phenix™高含量篩選系統的可比較結果和測定統計數據。由于Operetta CLS和Opera Phenix系統比傳統顯微鏡具有更高的通量，基于FRET的生物傳感器的高含量成像為藥物發現和細胞信號傳導中的基礎研究開辟了新的可能性。
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