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PCR的反應條件:
因擴增片段的大小、反應體積、使用擴增儀器的不同而不同。
◇ 循環次數
根據模板DNA的量以及擴增片段的大小,設定25~30個循環。
如果循環次數太少,擴增量不足;如果循環次數太多,則會出現Smear。
◇ Anneal以及Extension
合適的Anneal溫度通常在45~68℃之間 (預備實驗可2℃間隔進行)。另外,由于在60~68℃間,也有很高的活性, 因此可在此溫度范圍內設定Anneal-Extension溫度, 進行2 Step PCR。Anneal-Extension溫度為68℃ 時,每kbp大體可設定30秒~1分鐘;當溫度設定在68℃以下時, 時間設定可稍長一些。通常,Anneal溫度太高,有時會得不到擴增產物;Anneal溫度太低時,容易發生非特異性反應。另外,Extension時間太短時,會得不到擴增產物或者會有一些短的非特異性產物優成;而Extension時間太長時,會出現Smear。?
參數規格:
產品名稱:雞源性成分(Chicken)核酸定性檢測試劑盒
產品規格:50T
產品貨號:FS-P10694
產品分類:PCR法
產品運輸:低溫運輸
儲存條件:-20℃避光保存,避免反復凍融。
運輸:低溫、避光,快遞免費送貨上門。
產品特點:
本產品就是根據保守區設計引物而開發的高靈敏 PCR檢測試劑盒 。
實驗過程:
一、試劑準備
1. DNA模板
2.對應目的基因的特異引物(在PCR反應中,新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續按照模板DNA復制,而不能從無到有,憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物。可以是DNA也可以是RNA,一般20多bp,需要根據你的模板鏈設計。因此,擴增不同的基因需要設計不同的引物)
3.10×PCR Buffer
4.2mM dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5.Taq酶
二、操作步驟
1.在冰浴中,按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer 5μl
dNTP mixl 4μl
引物1(10pM) 2μl
引物2(10PM) 2μl
Taq酶(2U/μl) 1μl
DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl
加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋,不加或添加石蠟油。
2.調整好反應程序。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,執行擴增。一般:在93℃預變性3-5min,進入循環擴增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循環30-35次,zui后在72℃ 保溫7min。
3.結束反應,PCR產物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4.PCR的電泳檢測:如在反應管中加有石蠟油,需用100μlLuFang進行抽提反應混合液,以除去石蠟油;否則,直接取5-10μl電泳檢測。
定量PCR方法:
a、競爭法
選擇由突變克隆產生的含有一個新內切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中,待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增(其中一個引物為熒光標記)。擴增后用內切酶消化PCR產物,競爭性模板的產物被酶解為兩個片段,而待測模板不被酶切,可通過電泳或高效液相將兩種產物分開,分別測定熒光強度,根據已知模板推測未知模板的起始拷貝數。
b、內參照法
在不同的PCR反應管中加入已定量的內標和引物,內標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記,下游引物不標記。在模板擴增的同時,內標也被擴增。在PCR產物中,由于內標與靶模板的長度不同,二者的擴增產物可用電泳或高效液相分離開來,分別測定其熒光強度,以內標為對照定量待檢測模板。
c、PCR-ELISA法
利用di高辛或生物素等標記引物,擴增產物被固相板上特異的探針所結合,再加入抗di高辛或生物素酶標抗體-辣根過氧化物酶結合物,最終酶使底物顯色。常規的PCR-ELISA法只是定性實驗,若加入內標,作出標準曲線,也可實現定量檢測目的。
實時熒光定量PCR:
實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的局限,實現了每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度,并記錄在電腦軟件之中,通過對每個樣品Ct值的計算,根據標準曲線獲得定量結果。因此,實時熒光定量PCR無需內標是建立在兩個基礎之上的:
1)Ct值的重現性PCR循環在到達Ct值所在的循環數時,剛剛進入真正的指數擴增期(對數期),此時微小誤差尚未放大,因此Ct值的重現性,即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增,得到的Ct值是恒定的。
2)Ct值與起始模板的線性關系由于Ct值與起始模板的對數存在線性關系,可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定,因此,實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。
外標準曲線的定量方法相比內標法是一種準確的、值得信賴的科學方法。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確,重現性*定量方法,已得到的*,廣泛用于基因表達研究、轉基因研究,藥物療效考核、病原體檢測等諸多領域。
蘇云金芽孢桿菌生長條件: 30℃培養基: 0002提供形式: 凍干物安全等級: 1模式菌株: no 液氮超低溫凍結法;真空冷凍干燥法
產克雷伯氏菌對500mg/L的磺隆有抗性模式菌株: no土壤提供形式: 斜面培養物安全等級: 1培養基: 0033生長條件: 30℃
青霉屬活性物質;抗炎模式菌株: no土壤提供形式: 斜面培養物安全等級: 1培養基: CM0018生長條件: 28C
-1410℃冰箱凍結;真空冷凍干燥
黑細基格孢生長條件: 24℃培養基: 0390提供形式: 斜面培養物安全等級: 1模式菌株: no
沙福芽孢桿菌生物活性微生物/對養殖水體的病原性弧菌有明顯的抑制作用 產酶微生物/ 蛋白酶模式菌株: no漳浦蝦場養殖水體提供形式: 凍干物安全等級: 1培養基: 33生長條件: 28℃
苜蓿中華根瘤菌用于分類學和遺傳學研究,教學上也有應用,同時也篩選與豆科植物共生固氮的高效菌株用于實際。模式菌株: no根瘤提供形式: 凍干物安全等級: 1培養基: 0063生長條件: 28-30℃
ATCC14929培養基: 0002模式菌株: yes種屬: Arthrobacter│nicotianae提供形式: 凍干物安全等級: 1生長條件: 30℃ 真空冷凍干燥法;礦物油法;定期移植法
蘇云金芽孢桿菌庫爾斯塔克亞種培養基: 2模式菌株: no土壤提供形式: 斜面培養物安全等級: 1生長條件: 30 真空冷凍干燥法;定期移植法
IFO14187FRIBP1327培養基: 85模式菌株: no種屬: Bacillus│subtilis提供形式: 凍干物安全等級: 1生長條件: 37℃ 真空冷凍干燥法
-1411℃冰箱凍結;真空冷凍干燥
曲霉屬活性物質;抗炎模式菌株: no土壤提供形式: 斜面培養物安全等級: 1培養基: CM0014生長條件: 28C
優雅食烷菌培養基: 745有機污染物降解菌/石油烴類降解菌水樣/表層海水提供形式: 斜面培養物模式菌株: no生長條件: 28℃ 液氮超低溫凍結法;-80℃冰箱凍結法;真空冷凍干燥法
杏黃小菇生長條件: 25培養基: 14提供形式: 斜面培養物安全等級: 1模式菌株: no 定期移植法
云南葡萄穗霉產生真菌素模式菌株: no枯葉提供形式: 凍干物安全等級: 1培養基: CM0014生長條件: 26C
蠟狀芽孢桿菌生長條件: 30℃培養基: 0002提供形式: 凍干物安全等級: 2模式菌株: no 液氮超低溫凍結法;真空冷凍干燥法
異綠原CCaspase-9 白介素1-β轉化酶樣凋亡蛋白酶6(抗原) 大腸桿菌脂多糖IgG
蕓香柚皮苷Caspase-9 白介素1-β轉化酶樣凋亡蛋白酶6(抗原) 抗EphA1-R受體IgG
鳶尾黃素AD7C-NTP/NTP/AF peptide 神經絲蛋白蛋白多肽抗原(人) 兔抗人、大、小鼠酪氨蛋白激酶受體A2IgG
異麥角甾苷Caspase-10 半胱胺蛋白酶-10(抗原) 兔抗人、大、小鼠磷化酪氨蛋白激酶A2受體IgG
原蘇木素BCaspase-13 半胱胺蛋白酶蛋白-13(抗原) 酪氨蛋白激酶受體A4IgG
異鼠李素-3-O-新橙CD19(B-lymphocyte antigen CD19) CD19 抗酪氨蛋白激酶A4IgG
標準品Clenbuterol Hydrochloride/BSA 鹽克侖特羅偶聯牛血清白蛋白BSA抗體
異槲皮苷Clenbuterol Hydrochloride/KLH 鹽克侖特羅偶聯血藍蛋白KLH 酪氨蛋白激酶受體B2IgG
乙酰紫堇靈Estradiol/BSA 雌二醇偶聯牛血清白蛋白 酪氨蛋白激酶受體B6IgG
原花青素B1DRADA/ADAR1(Double-stranded RNA-specific adenosine deaminase)N terminal 雙鏈RNA腺苷脫氨基酶抗原(N端) 紅生成素受體IgG
雞源性成分(Chicken)核酸定性檢測試劑盒MeclofenoxateHCl 鹽甲芬酯(標準品) 質量規格:>95%
MegestrolAcetate 醋甲地孕 質量規格:>95%
MegestrolAcetate 醋甲地孕(標準品) 質量規格:>95%
MelanotanⅡAcetate 美拉諾坦II;MTII 質量規格:>95%
Meloxicam 美洛昔康 質量規格:>95%
Meloxicam 美洛昔康(標準品) 質量規格:>95%
MemantineHCl 鹽美金剛胺 質量規格:>95%
Memantinehydrochloride 鹽美金剛(標準品) 質量規格:>95%(HPLC),BC
Methotrexate 甲氨蝶呤 質量規格:>95%(HPLC),BC
Methotrexate 甲氨蝶呤(標準品) 質量規格:>95%(HPLC),BC
Nimesulide 尼美舒利 質量規格:>95%(HPLC),BC
MiconazoleNitrate 硝咪康唑 質量規格:>95%(HPLC),BC
MiconazoleNitrate 硝咪康唑(標準品) 質量規格:>95%(HPLC),進分
MicronomicinSulfate 硫小諾霉素/硫小諾米星/硫沙加霉素 質量規格:>95%(T)
MicronomicinSulfate 小諾霉素(標準品) 質量規格:>95%(TPOMethod)
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