細胞培養操作規程：

一．培養基及培養凍存條件準備：

1）準備RPMI-1640培養基(RPMI-1640：GIBCO，貨號21875-091)，90%；優質胎牛血清，10%。

2）培養條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配，液氮儲存。

二．細胞處理：

1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養基的培養瓶中培養過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。

對于懸浮細胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細胞，1000RPM，常溫條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養基的新皿中或者瓶中。

產品屬于：

產品名稱：復蘇專用因子    

英文名稱：Y27632

貨號：FS-02X0023

規格：1mg   

細胞培養的優點：

注意事項：

 Cytovillin (CVL)細胞絨毛蛋白(CVL)檢測試劑盒(聯免疫吸附試驗法)規格：48T/96T

 Large Neutral Amino Acid Transporter 1 (LAT1)大型中性基轉運蛋白1(LAT1)檢測試劑盒(聯免疫吸附試驗法)規格：48T/96T

 Interleukin 8 Receptor Beta (IL8Rb)白介8受體β(IL8Rβ)檢測試劑盒(聯免疫吸附試驗法)規格：48T/96T

 Interleukin 34 (IL34)白介34(IL34)檢測試劑盒(聯免疫吸附試驗法)規格：48T/96T

 Interleukin 34 (IL34)白介34(IL34)檢測試劑盒(聯免疫吸附試驗法)規格：48T/96T

 Big Dynorphin (Dyn)強啡(Dyn)檢測試劑盒(聯免疫吸附試驗法)規格：48T/96T

 Enkephalin (ENK)腦啡(ENK)檢測試劑盒(聯免疫吸附試驗法)規格：48T/96T

 Fibroblast Growth Factor Receptor Substrate 2 (FRS2)成纖維生長因子受體底物2(FRS2)檢測試劑盒(聯免疫吸附試驗法)規格：48T/96T

 Interleukin 24 (IL24)白細胞介24(IL24)檢測試劑盒(聯免疫吸附試驗法)規格：48T/96T

 Metallothionein 1 (MT1)金屬硫蛋白1(MT1)檢測試劑盒(聯免疫吸附試驗法)規格：48T/96T

 Myostatin (MSTN)肌肉生長抑制(MSTN)檢測試劑盒(聯免疫吸附試驗法)規格：48T/96T

 Carbonic Anhydrase II (CA2)碳酐Ⅱ(CA2)檢測試劑盒(聯免疫吸附試驗法)規格：48T/96T

 Ceruletide (INN)雨蛙(INN)檢測試劑盒(聯免疫吸附試驗法)規格：48T/96T

 Alpha-2-Heremans Schmid Glycoprotein (aHSG)α2-HS糖蛋白(αHSG)檢測試劑盒(聯免疫吸附試驗法)規格：48T/96T

 Receptor Activator Of Nuclear Factor Kappa B Ligand (RANkL)核因子κB受體激活因子配基(RANκL)檢測試劑盒(聯免疫吸附試驗法)規格：48T/96T

 Early Growth Response Protein 4 (EGR4)早期生長應答因子4(EGR4)檢測試劑盒(聯免疫吸附試驗法)規格：48T/96T

 Glucose 6 Phosphate Dehydrogenase (G6PD)葡萄糖6磷脫氫(G6PD)檢測試劑盒(聯免疫吸附試驗法)規格：48T/96T

 Glucose 6 Phosphate Dehydrogenase (G6PD)葡萄糖6磷脫氫(G6PD)檢測試劑盒(聯免疫吸附試驗法)規格：48T/96T
復蘇專用因子IRX5  Iroquois同源蛋白5抗體規格: 0.2ml

MEF2B  肌細胞增強因子2B抗體規格: 0.2ml

MESP1  心血管發育中胚層相關蛋白1抗體規格: 0.2ml

Myocardin  促血管平滑肌細胞分化因子抗體規格: 0.2ml

NFAT5  活化T細胞核因子5蛋白抗體規格: 0.2ml

phospho-NFAT5 (Ser1197)  磷化活化T細胞核因子5蛋白抗體規格: 0.1ml

CNN2  平滑肌鈣調蛋白CNN2抗體規格: 0.2ml

Wnt16  信號通路Wnt16抗體規格: 0.2ml
實驗報告：

一、分離與培養：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養基混懸，接種于25cm2培養瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養箱中培養；

5、差速貼壁1h后，吸出培養基，按實驗需要接種于6孔板中繼續培養；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。