PCR反應設計引物需考慮問題：

1．酶切位點

兩個酶切位點應是載體上的，所連接片斷上沒有這兩個位點，且距離不能太近，否則往往導致兩個酶都切不好。因此，兩個酶切位點要緊挨在一起，只能切一個，除非恰好是與上面兩個酶在一起的酶切位點，最好隔四個核苷酸。且不能有堿基的交叉，比如AGATCTTAAG，這樣的位點比較難切。

2．酶的選擇

最好使用雙酶切效率高的，但兩個酶切點最好不要是同尾酶（切下來的殘基不要互補），否則效果相當于單酶切，最好使用具有共同buffer，且較常用的酶（如hind3，bamh1，ecor1等），這樣可以省錢。

3．Tm的計算。

Tm是由互補的DNA區域決定的，而不互補的區域對DNA的溶解是沒有作用的。因此，對于引物的Tm，只有和模板互補的區域對Tm才有貢獻。計算Tm時，只計算互補的區域（除非你的酶切位點也與模板互補）。設計引物的時候，先不管5'端的修飾序列，把互補區的Tm控制在55度以上（我喜歡控制在58以上，具體根據PCR的具體情況，對于困難的PCR，需要適當提高Tm），再加上酶切位點和保護堿基，這樣的引物通常都是可用的，即使有小的問題，也可以挽回。

Tm溫度高的引物就比較容易克服3’發卡、二聚體及3'非特異結合等問題。簡單的計算公式可以用2+4的公式。若你計算的Tm值達到了快90 ，不包括酶切位點。引物公司給你發的單子是包括酶切位點的。自己可以再估計一下。如你設計了帶酶切位點的引物，總長分別為29、33個堿基，去掉酶切位點和保護堿基，分別為17、21個堿基。引物公司給的單子是70多度，實際用的只有50度，用55度擴的結果也差不多。

其它關于Tm值的計算，有用PP5.0進行評價的，需要考慮base number、GC%、Tm、hairpin、dimer、false priming、cross dimer等參數。

4．退火溫度

退一般退火溫度為Tm-5度，退火溫度的計算可以不把加入的酶切位點及保護堿基考慮進去， PCR幾個循環后，引物外側的序列已經參入了擴增片斷中，所以你可以在預變性后多加幾步，溫度比你Tm值低些（這樣可能會增加非特異性），Tm值是你包括酶切位點及保護堿基的Primer計算出來的。

5．5’端保護堿基

一般在5'端加保護堿基,如果你擴增后把目的條帶做膠回收轉入T-VECTOR或者其它的載體的話,酶切時可以不需加保護堿基

6．引物二聚體

關于引物二聚體，最好用primer或是其他設計引物的軟件進行計算一下，看看引物之間的△G（自由能）的絕對值，如果小于10，一般是問題的。如果稍大，PCR時可以提高一下退火溫度，一般是沒有問題的。如果3’端形成二聚體，并且自由能絕對值較大，如果 PCR沒有條帶，建議重新設計引物。此外，所加的三個核苷酸的保護序列經過盡心設計有時也可以降低二聚體的△G。

7．引物的設計

在設計酶切位點時，最好能盡可能多的利用引物本身的堿基。這是因為，一個特異性引物一般都是20bp左右，再加上酶切位點序列和保護性堿基，大致就是28bp左右了。而我們在設計退火溫度時，與引物的長度有關，比正常的引物(20bp) 的Tm肯定要高一些。如果我們能利用引物自身的部分序列，就可以有效地減少引物的長度。

還有，有些酶是離不開末端序列的，因此，在設計一個酶位點時，最好把該酶的性質弄清楚。設計時限制性酶切位點是應該在5’端的頂端。在設計引物時，常在5’端添加酶切位點，以利于PCR產物連接到載體。

設計引物時保證在最后5個核苷中含有3個A或T。先用軟件設計出合適的引物，引物的3’端是引發延伸的起點，因此一定要與模板準確配對，應盡量避免在引物3’端的第1位堿基是A（容易錯配）。引物3’端最佳堿基的選擇是G和C，因為他們形成的堿基配對比較穩定。目的序列上并不存在的。