蛋白激酶B試劑盒說明書

標本要求: 

1．標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融

2．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

樣本處理及要求：
1.血清：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2.  血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8°C 1000g離心20分鐘，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3.  組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復(fù)凍融。將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。
4.  細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

試劑盒特點:

1、高效、靈敏、特異的抗體;

2、穩(wěn)定的重復(fù)性和可靠性;

3、吸附性能好，空白值低，孔底透明度高的固相載體;

4、適用血清、血漿、組織勻漿液、細胞培養(yǎng)上清液、尿液等等多種標本類型;

5、節(jié)省實驗經(jīng)費。

實驗原理:

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中血清素/血清胺(ST)水平。用純化的血清素/血清胺(ST)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入血清素/血清胺(ST)，再與HRP標記的血清素/血清胺(ST)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹di 洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶S的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的血清素/血清胺(ST)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中血清素/血清胺(ST)濃度。

操作步驟：

1. 標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。

2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。   

4. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用

5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。

7. 溫育：操作同3。

8. 洗滌：操作同5。

9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘.

10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。

11. 測定：以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。

操作程序總結(jié)：

計算：

  以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

注意事項：

1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。

3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

4． 請每次測定的同時做標準曲線，最好做復(fù)孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標準品孔第一孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。

5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6．底物請避光保存。

7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.

8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。

9．本試劑不同批號組分不得混用。

保存條件及有效期：

1．試劑盒保存：；2-8℃。

2．有效期：6個月。