【儀表網 儀表標準】為貫徹《中華人民共和國環境保護法》，規范生態環境監測工作，生態環境部現批準《水質 滅菌生物指示物(枯草芽孢桿菌黑色變種)的鑒定 生物學檢測法》標準為國家生態環境標準，并予發布。本標準自2022年4月1日起實施。
 

　　為貫徹《中華人民共和國環境保護法》《中華人民共和國水污染防治法》，防治生態環境污染，改善生態環境質量，規范水中滅菌生物指示物(枯草芽孢桿菌黑色變種)的鑒定方法，制定本標準。
 

　　本標準為首次發布。本標準規定了鑒定水中滅菌生物指示物(枯草芽孢桿菌黑色變種)的生物學方法，用于微生物實驗室滅菌效果的評價。
 

　　本標準引用了下列文件或其中的條款。凡是注明日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本標準。凡是未注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本標準。《消毒技術規范》(原衛生部衛法監發〔2002〕282 號)。
 

　　方法原理：
 

　　經滅菌處置后含枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢的水樣通過孔徑為 0.45 μm 的濾膜過濾，細菌和芽孢被截留在濾膜上，然后將濾膜置于酪氨酸瓊脂培養基上，36 ℃±1 ℃培養 72 h～96 h，枯草芽孢桿菌黑色變種產生的酪氨酸酶可分解并利用酪氨酸形成黑色素，產生黑色的特征菌落。對特征菌落進行染色鏡檢后通過生化試驗做進一步鑒定，能利用甘油和甘露糖，可還原硝酸鹽和水解淀粉，不能利用苦杏仁苷和甘露醇，并確認為革蘭氏陽性芽孢桿菌的特征菌落為枯草芽孢桿菌黑色變種，鑒定結果為陽性。
 

　　儀器和設備：
 

　　1. 樣品瓶：螺口帶蓋或磨口具塞的 250 ml、500 ml 廣口玻璃瓶。
 

　　2. 恒溫培養箱：36 ℃±1 ℃。
 

　　3. 高壓蒸汽滅菌器：121 ℃，可調。
 

　　4. pH 計：準確到 0.1 pH 單位或更高精度。也可使用 pH 精密試紙。
 

　　5. 顯微鏡：物鏡 4×或 5×、10×、20×、40×，油鏡 100×，目鏡 10×或 15×。
 

　　6. 分析天平：實際分度值 0.0001 g。
 

　　7. 培養皿：直徑 90 mm。
 

　　8. 過濾裝置：配有砂芯濾器、圓筒形玻璃漏斗和真空泵，抽濾壓力不低于-50 kPa。
 

　　9. 接種環：直徑 1 mm～3 mm。
 

　　10. 鑷子：不銹鋼或一次性無菌塑料鑷子。
 

　　11. 刻度移液管：1 ml、10 ml。也可使用可調式移液器。
 

　　12. 量筒：100 ml。 6.13 錐形瓶：100 ml。 6.14 酒精燈。
 

　　15. 試管：10 ml。 6.16 無菌操作設備：無菌室、超凈工作臺、生物安全柜。
 

　　17. 一般實驗室常用儀器和設備。
 

　　樣品采集：
 

　　評價使用高溫高壓滅菌設備的滅菌效果時，取樣品瓶，加入枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢懸液及 200 ml 無菌水使混合液中枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢終濃度達到 5×104 CFU/ml～ 5×105 CFU/ml。滅菌處置完畢后，取出樣品瓶，對水樣進行滅菌生物指示物(枯草芽孢桿菌黑色變種)的檢測。
 

　　評價使用其它滅菌設備的滅菌效果時，滅菌前取適量枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢懸液加入滅菌設備，使水樣中枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢終濃度達到 5×104 CFU/ml～5×105 CFU/ml。滅菌處置完畢后，從滅菌設備中采集水樣，進行滅菌生物指示物(枯草芽孢桿菌黑色變種)的檢測。采樣量一般為樣品瓶容量的 80%左右，不得用樣品洗滌樣品瓶。樣品采集完畢后，迅速用無菌包裝紙包扎樣品瓶。

 

　　本標準適用于微生物實驗室滅菌效果的評價。