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人胃壁細胞抗體(PCA) ELISA 檢測試劑盒說明書

時間:2010-10-17閱讀:262
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人(Human)胃壁細胞抗體(PCA) ELISA 檢測試劑盒
用 途:
人PCA ELISA試劑盒用于體外定量檢測血清、血漿、組織、緩沖液中細胞上清液及各種體液中的PCA 。本試劑盒可以檢測天然和重組的PCA 。本試劑盒于科研、而非用于臨床診斷。

試驗原理:
人PCA 試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA).已知PCA 濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內(nèi)進行檢測。先將PCA 和*標記的抗體同時溫育。洗滌后,加入親和素標記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌,去除未結(jié)合的酶結(jié)合物,然后加入底物A、B,和酶結(jié)合物同時作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中PCA 的濃度呈比例關系。

試劑盒內(nèi)容及其配制
試劑盒成份(2-8℃保存) 96孔配置 48孔配置 配制
96/48人份酶標板 1塊板(96T) 半塊板(48T) 即用型
塑料膜板蓋 1塊 半塊 即用型
標準品:8.0IU/ml 1瓶(0.6ml) 1瓶(0.3ml) 按說明書進行稀稀
空白對照 1瓶(1.0ml) 1瓶(0.5ml) 即用型
標準品稀釋緩沖液 1瓶(5ml) 1瓶(2.5ml) 即用型
*標記的抗PCA抗體 1瓶(6ml) 1瓶(3.0ml) 即用型
親和鏈酶素-HRP 1瓶(10ml) 1瓶(5.0ml) 即用型
洗滌緩沖液 1瓶(60ml) 1瓶(30ml) 按說明書進行稀釋
底物A 1瓶(6.0ml) 1瓶(3.0ml) 即用型
底物B 1瓶(6.0ml) 1瓶(3.0ml) 即用型
終止液 1瓶(6.0ml) 1瓶(3.0ml) 即用型

自備材料
1. 蒸餾水。
2. 加樣器:5ul、10 ul、50 ul、100 ul、200、500 u、1000lul。
3. 振蕩器及磁力攪拌器等。

安全性
1. 此試劑盒的人血制品中的HbsAg、和抗HIV為陰性,但沒有實驗室可*保證此血制品不會傳染肝炎、AIDS或其它傳染病,依據(jù)當?shù)氐陌踩珬l例處理本試劑盒里的成份及血清和血漿等樣品。
2. 避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體,請盡快用水沖洗。
3. 實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
4. 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。


操作注意事項
1. 試劑應按標簽說明書儲存,使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄,不可保存。
2. 實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中,密封保存,以免變質(zhì)。
3. 不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
4. 使用一次性的吸頭以免交叉污染,吸取終止液和底物A、B液時,避免使用帶金屬部分的加樣器。
5. 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
6. 洗滌酶標板時應充分拍干,不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。
7. 底物A應揮發(fā),避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感,避免長時間暴露于光下。避免用手接觸,有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。
8. 加入試劑的順序應一致,以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。
9. 按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

樣品收集、處理及保存方法
1、 血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后,1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2、 血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
3、 細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4、 保存------如果樣品不立即使用,應將其分成小部分-70 ℃保存,避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒,檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

試劑的準備
1. 標準品:標準品的系列稀釋應在實驗時準備,不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行:
8.0 IU/ml (6號標準品) 原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。
4.0 IU/ml (5號標準品) 100ul的原倍標準品加入100ul的標準品稀釋液
2.0 IU/ml (4號標準品) 100ul的5號標準品加入100ul的標準品稀釋液
1.0 IU/ml (3號標準品) 100ul的4號標準品加入100ul的標準品稀釋液
0.5 IU/ml (2號標準品) 100ul的3號標準品加入100ul的標準品稀釋液
0.25 IU/ml (1號標準品) 100ul的2號標準品加入100ul的標準品稀釋液
0 IU/ml (空白對照) 原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

2. 洗滌緩沖液(20×)的稀釋:蒸餾水20倍稀釋。

操作步驟
1. 使用前,將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫,以免加樣時加入大量的氣泡,產(chǎn)生加樣上的誤差。
2. 根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定,能使用復孔的盡量做復孔。
3. 加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內(nèi)。立即加入50ul的*標記的抗體。蓋上膜板,輕輕振蕩混勻,37℃溫育1小時。
4. 甩去孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復此操作四次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數(shù)增加一次。
5. 每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP,輕輕振蕩混勻,37℃溫育30分鐘。
6. 甩去孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復此操作四次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數(shù)增加一次。
7. 每孔加入底物A、B各50ul,輕輕振蕩混勻,37℃溫育15分鐘。避免光照。
8. 取出酶標板,迅速加入50ul終止液,加入終止液后應立即測定結(jié)果。
9. 在450nm波長處測定各孔的OD值。

建議使用的實驗方案
 標準品濃度(IU/ml) 
A 8.0 8.0 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
B 4.0 4.0 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
C 2.0 2.0 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
D 1.0 1.0 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
E 0.5 0.5 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
F 0.25 0.25 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
G 0 0 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
H 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品

結(jié)果分析
以吸光度OD值為縱坐標(Y),相應的PCA 標準品濃度為橫坐標(X),做得相應的曲線,樣品的PCA 含量可根據(jù)其OD值由標準曲線換算出相應的濃度。

局限
6號標準品以上的結(jié)果為非線性的,根據(jù)此標準曲線無法得到的結(jié)果。

試劑盒性能
1. 靈敏度:zui小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R值為0.990。
2. 特異性:不與人其它細胞因子反應。
3. 重復性:板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。


 

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