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公司于2025從CFE已奪得累計價值逾20.8032億[詳情]免疫熒光(IF)是一種用于可視化觀察細胞內(nèi)過程、狀態(tài)和結(jié)構(gòu)的強大工具。 IF制劑可通過多種顯微鏡技術(shù)（如激光共聚焦、寬場熒光、全內(nèi)反射成像、基態(tài)淬滅顯微成像等）來加以分析，具體取決于應(yīng)用目的或研究人員的關(guān)注重點。 與此同時，在很多使用至少一套簡易熒光顯微鏡的研究工作組當(dāng)中，IF早已成為的一部分。
IF實驗的核心部分是兩種不同組分的組合：
首先是特異性抗體，用于形成免疫復(fù)合物來標(biāo)記細胞內(nèi)需要研究的分子，大多數(shù)情況下為蛋白質(zhì)。
其次是熒光色素，與免疫復(fù)合物耦合，因此可以用顯微鏡觀察目標(biāo)結(jié)構(gòu)。
標(biāo)準(zhǔn)IF流程
IF實驗所需時間：約5個小時。
這是一種蓋玻片上通過化學(xué)交聯(lián)劑進行固定的培育細胞接受間接IF檢查的標(biāo)準(zhǔn)方案。
· 濕盒非常適合IF實驗，并且可以輕松完成自制（見幻燈片“如何制備濕盒”）。該處理可防止試劑干燥并允許在黑暗中進行培養(yǎng)，這對于處理熒光色素很重要，并且對于已經(jīng)存在的熒光蛋白是必要的。
· 試劑用量的選擇要確保蓋玻片能夠濕潤。確保樣本不會干燥。
· 所有培育步驟都在室溫下完成。
1. 清洗細胞兩次并使用鑷子小心地將帶有向上翻轉(zhuǎn)細胞的蓋玻片放入濕盒。
2. 使用4% 福爾馬林進行10分鐘的固定并清洗3次。
3. 使用0.1% TX-100/PBS進行15-20分鐘的透化處理并清洗3次。
4. 使用5%正常山羊血清/PBS或1% BSA/PBS進行45分鐘的封閉（無需清洗）。
5. 在封閉溶液內(nèi)稀釋一抗并使用2小時（或在4℃下連夜使用）。清洗4次將未結(jié)合的一抗清除掉。
6. 使用二抗進行1個小時的孵育，在封閉溶液或清洗緩沖液內(nèi)進行稀釋。
7. 吸取二抗，如有需要可使用Hoechst或DAPI [1 μg/ML]在PBS當(dāng)中孵育10分鐘。清洗4次，即便此時還沒有出現(xiàn)細胞核染色。
8. 用鑷子輕輕取出蓋玻片并將其進入H2O內(nèi)，清除掉清洗緩沖液的殘留鹽分。
9. 在顯微鏡載玻片上滴一滴封固溶液并將蓋玻片與細胞倒置這滴溶液上。用鑷子輕輕按壓試樣，使封固介質(zhì)均勻分布而不會擠壓樣本。
10.固化后就準(zhǔn)備好進行顯微鏡觀察了。
配方
清洗緩沖液
· 1 × PBS（磷酸鹽生理鹽水緩沖液）
1. 137 mM：NaCI
2. 2.7 mM：KCI
3. 10mM：Na2HPO4
4. 1.8 mM：KH2PO4
· 使用HCI將pH值調(diào)節(jié)到7.2-7.4
· 如為PBS++，需添加最終濃度為1 mM的CaCl2和MgCl2
· 如為PBS-T，需添加最終濃度為0.05%的Tween 20
固定緩沖液
· 福爾馬林：
1. 將4% PFA（多聚甲醛）溶解于溫暖（50-70℃）的dH2O當(dāng)中，pH值8（使用NaOH進行調(diào)節(jié)）。
2. 將10 × PBS添加到最終濃度為1 × PBS的溶液當(dāng)中（如100 mL 10 × PBS溶于900 mL 4% PFA/dH2O）。
3. 使用HCI將pH值調(diào)節(jié)到7.2-7.4。
· 甲醇（預(yù)先冷凍至-20℃）：
1. 99%甲醇（-20℃）
· 甲醇/丙酮（預(yù)先冷凍至 -20℃）：
1. 50%甲醇（-20℃）和50 %丙酮（-20℃）
透化緩沖液
· TX-100（Triton X-100)：
1. PBS，最終濃度0.1% TX-100
· 皂甙：
1. PBS，最終濃度0.1%的皂甙
· 其他清潔劑可在PBS當(dāng)中以相同濃度進行使用。
封閉緩沖液
· BSA（牛血清蛋白）：
1. PBS，最終濃度為1% BSA
· 奶粉：
1. PBS，最終濃度為1%奶粉
· 正常血清：
1. PBS，最終濃度為5%正常血清
細胞核染料
· Hoechst或DAPI：
1. 在PBS中制備Hoechst 33342或DAPI溶液，最終工作濃度為1 μg/mL。
