產(chǎn)品名稱(chēng)：TonkBio cDNA *鏈合成試劑盒

英文名稱(chēng)：TonkBio First Chain cDNA Synthesis Kit

產(chǎn)品描述：TonkBio cDNA *鏈合成試劑盒是專(zhuān)門(mén)用于兩步法RT-PCR的*步，含有合成高質(zhì)量*鏈cDNA所需的所有成分，適用于后續(xù)的PCR、qPCR以及基因克隆。采用的是無(wú)RNase H活性的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，避免了*鏈cDNA合成過(guò)程中RNA/DNA雜交體中RNA被降解，具有的逆轉(zhuǎn)錄活性，適合合成長(zhǎng)達(dá)9 k的cDNA片段。

產(chǎn)品特點(diǎn)：優(yōu)化配制了用于*鏈cDNA合成反應(yīng)的各種成分，試劑盒中的ToneScript M-MLV具有的逆轉(zhuǎn)錄活性，避免了*鏈cDNA合成過(guò)程中RNA/DNA雜交體中RNA被降解，具有的逆轉(zhuǎn)錄活性。適合后續(xù)的PCR、定量PCR以及PCR克隆，適用于各種PCR耐熱聚合酶。

應(yīng)用舉例：反轉(zhuǎn)錄性

常見(jiàn)問(wèn)題解析：

1、 沒(méi)有RT-PCR產(chǎn)物或產(chǎn)量低

◆RNA模板降解。RNA 的純度和完整對(duì)于反轉(zhuǎn)錄得到全長(zhǎng)cDNA是非常重要的。提取的RNA應(yīng)進(jìn)行電泳檢測(cè)以確定其是否降解。同時(shí)RNA要避免多次反復(fù)凍融。

◆RNA模板純度低。提取RNA的過(guò)程中，可能殘留一些鹽離子、試劑，如 EDTA、酚、胍鹽、磷酸鹽、多胺等抑制接下來(lái)的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。建議用75%乙醇（DEPC 水配制）仔細(xì)清洗RNA沉淀。

◆引物不合適。選擇合適的引物，當(dāng)RNA是細(xì)菌RNA或者是沒(méi)有polyA尾的RNA要選擇隨機(jī)引物或者特異引物。

◆目的基因含有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)或高GC含量。建議選擇隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。將反轉(zhuǎn)錄溫度提高至55℃。

2、RT-PCR 產(chǎn)物比預(yù)期長(zhǎng)

◆RNA 中很可能污染了DNA。真核生物基因組DNA中含有內(nèi)含子，可能參與了 PCR擴(kuò)增，可以在反轉(zhuǎn)錄之前對(duì)RNA進(jìn)行DNaseI的消化。

3、陰性對(duì)照中有RT-PCR產(chǎn)物

◆陰性對(duì)照中有RT-PCR產(chǎn)物也表明有DNA的污染。在反轉(zhuǎn)錄之前對(duì)RNA進(jìn)行DNase I 的消化。